Etapele diagnosticului de laborator al bolilor virale. Dispozitivul laboratorului virologic.
1) Indicarea (detectarea) virusului în materialul patologic:
Metode expres:
a) Detectarea virionului:
(1) Microscopia electronică;
(2) Microscopie cu lumină (variola);
b) Detectarea AG viral în reacțiile serologice (RIF, ELISA, RSK, RDP, RNGA);
c) Detectarea corpurilor de incluziune prin microscopie luminoasă și fluorescentă;
d) Detectarea acizilor nucleici virali prin PCR, sonde ADN;
e) Detectarea hemaglutininelor în RHA;
f) Detectarea activității infecțioase a virusului în biotestul.
2) Izolarea (izolarea) virusului din materialul patologic. Izolarea se realizează indiferent de rezultatele primei etape prin metoda de testare biologică în trei pasaje „oarbe”. Trecere este infectarea unui sistem viu pentru a obține o nouă populație de virus. Pasaj „orb”.- infecție fără semne vizibile de reproducere a virusului. După trei treceri în celulele unui sistem viu, virusul se acumulează, ceea ce este însoțit de apariția semnelor de reproducere, vizibile la nivelul macroorganismului. De exemplu, când biotest pe animale: semne clinice, deces, modificări patologice; pe embrioni de pui- deces, modificări patologice, hemaglutinare; pe cultură de celule– CPE, hemadsorbție, plăci, RIF etc. Astfel de sisteme vii infectate sunt definite ca un biotest pozitiv. Cu toate acestea, nu este încă posibil să se determine cu exactitate tipul de agent infecțios. Prin urmare, materialul patologic este luat dintr-un biotest pozitiv, care este considerat condiționat secundar, adică. selectat dintr-un sistem viu cu semne de biotest pozitiv. Din aceasta se prepară o suspensie care conține virus sau tampoane-amprente (virus izolat).
3) Identificarea (determinarea speciei) virusului izolat în reacții serologice sau prin analiză PCR. În cazuri rare, identificarea prin alte semne este posibilă, de exemplu, prin incluziuni intracelulare (corpii Babes-Negri pentru rabie).
4) Dacă este necesar, dovada rolului etiologic al virusului izolat. Pentru aceasta, se folosesc reacții serologice, în care un virus izolat este utilizat ca antigen și probe de ser de sânge pereche în diluții în serie de două ori sunt folosite ca anticorpi. Un rezultat pozitiv, care demonstrează rolul etiologic al virusului izolat, este o creștere a titrului de anticorpi în a doua probă de ser sanguin comparativ cu prima de 4 sau mai multe ori.
5) Diagnosticul retrospectiv. În acest scop, se utilizează seruri de sânge pereche prelevate în stadiul de recuperare, care sunt examinate în reacții serologice cu un antigen specific standard în conformitate cu un diagnostic preliminar al unei boli virale. O creștere a titrului de anticorpi de 4 sau mai multe ori în a doua probă în comparație cu prima mărturisește un proces infecțios activ care are loc în corpul animalului în timpul perioadei de prelevare a sângelui din acesta. În acest caz, boala este cauzată de virusul la care s-a stabilit o creștere a titrului de anticorpi în serurile pereche.
Dispozitivul laboratorului virologic.
Pentru organizarea unui laborator de diagnostic se folosește un compartiment izolat, format din cel puțin 5-6 încăperi.
Sub laborator alocați o cameră luminoasă. Încăperile pentru lucrul cu material viral ar trebui să fie bine iluminate și să fie formate dintr-o anticameră și o cutie separate printr-un perete despărțitor de sticlă cu uși. În cutii se pun doar mese, scaune și accesorii pentru lucru. Suprafața meselor este acoperită cu oțel inoxidabil, plastic sau sticlă, iar deasupra suprafeței de lucru sunt instalate lămpi bactericide. La intrarea in cutie se aseaza un covor de dezinfectare spongios din cauciuc imbibat in dezinfectant. In pre-cutie se gasesc haine sterile si echipamente corespunzatoare scopului cutiei. Laboratorul este prevazut cu apa rece si calda si ventilatie cu alimentare cu aer steril.
Pentru înregistrarea materialului patologic primit este destinat recepţie, unde sunt așezate mai multe mese, tapițate cu tablă zincată, și recipiente cu dezinfectanți (3% cloramină, hidroxid de sodiu sau 5% fenol).
În camera de pretratare a materialelor ( deschidere) deschide cadavre și selectează material pentru cercetări ulterioare.
Cutiile-camera sunt echipate in functie de scop.
Vasele, mediile nutritive, echipamentele, mediile nutritive sunt sterilizate într-o autoclavă, iar materialul infecțios este neutralizat. Este necesar să existe două autoclave: pentru materiale curate și pentru cele infectate.
Spălarea este destinată spălării vaselor, a echipamentelor și a aparatelor.
Vivariumul trebuie să aibă un departament de carantină, încăperi pentru animale sănătoase și de experiment și încăperi de utilitate.
Pentru un laborator de virologie de orice tip, o cutie de banc, sau de preferat o cutie cu alimentare cu aer laminar, este o parte obligatorie a laboratorului.
Laboratorul de virologie lucrează la izolarea tulpinilor de virus, la identificarea și cultivarea acestora, fiind efectuate diverse studii științifice. Când lucrați cu viruși, trebuie în primul rând:
1. Evitați contaminarea tulpinilor de virus cu microflora străină;
2. Asigurarea securității personalului care lucrează împotriva posibilei infecții cu viruși;
3. Asigurarea siguranței populației din jur de infectarea cu infecții virale prin canalizare, cadavrele animalelor de experiment etc.
În studiul materialelor obținute de la pacienții cu infecții virale, în scopul diagnosticării de laborator a acestor boli, diverse metode:
· Metode de microscopie electronică și, într-o măsură mai mică, de microscopie luminoasă;
· Metode de izolare și cultivare a virusurilor în culturi celulare;
· Metode de izolare și cultivare a virusurilor în embrioni de pui în curs de dezvoltare și la animalele de experiment sensibile;
Detectarea virusurilor prin capacitatea lor de hemaglutinare;
· Diverse metode de cercetare serologică: metode tradiţionale şi exprese;
· Metode de cercetare genetică moleculară – hibridizare moleculară și reacție în lanț a polimerazei.
1.1.2. Materiale testate pentru infecții virale
Atunci când se preia material infecțios de la oameni și animale, este necesar să se țină seama de tropismul virusurilor la anumite țesuturi și organe, modalitățile în care virusul este izolat în timpul Mediul externși caracteristicile patogenezei unei anumite infecții virale.
Există virusuri pneumotrope, enterotropice, hepatotropice, limfotropice, neurotropice și dermotropice. În funcție de tropism, studiul este supus diverse materiale. De exemplu, ei examinează mucusul din gât, spută etc., dacă virusul este pneumotrop; mișcările intestinale - cu virusuri enterotropice; lichid din vezicule sau pustule, cruste - daca virusul are dermotropism etc.
1.1.3. Manipularea materialelor care conțin viruși
Materialele infecțioase, ținând cont de tropismul virusurilor și cu asepsie, se pun într-un recipient steril, sigilat cu grijă și trimis la laborator, introdus într-un termos cu gheață.
Se recomandă examinarea materialului cât mai curând posibil, deoarece virușii sunt rapid inactivați. Conservarea virusului este facilitată prin plasarea materialului de testat (într-o soluție de glicerol 50%) într-un frigider la o temperatură care să nu depășească 5 ° C. Dar cel mai mod de încredere- aceasta este depozitarea în stare congelată la o temperatură de -45 ° C și mai mică; în astfel de condiții, virusul poate rămâne viabil mult timp.
Prelucrarea materialului dens care conține viruși începe cu măcinarea lui într-un mortar sau măcinarea lui în dispozitive speciale - omogenizatoare. Apoi se prepară o suspensie 10% în soluție salină, care este centrifugata la 2000-3000 rpm timp de 15-30 minute pentru a precipita particulele mari. Virușii rămân în supernatant, care este supus cercetărilor ulterioare.
Materialul lichid care conține virusul este centrifugat direct și se obține, de asemenea, un supernatant.
Dacă există îndoieli cu privire la sterilitatea bacteriologică a supernatantului testat care conține virusul, i se adaugă antibiotice pentru a distruge microorganismele străine. Antibioticele nu afectează virușii și rămân viabile.
1.1.4.Metode de cercetare microscopică în virologie
- Microscopia electronică
Preparatele de electroni sunt preparate din suspensii purificate și concentrate care conțin virus sau secțiuni de țesut ultrasubțire infectate cu virusuri. Obiectele virus sunt aplicate pe substraturi speciale de film plasate pe grile de susținere. Filmele de substrat trebuie să fie foarte subțiri (nu mai mult de 30 nm grosime), transparente și suficient de puternice, de exemplu, carbon coloidal. Foliile se aplica pe plase de sustinere din cupru (2-3 mm diametru) cu numeroase gauri. În plus, preparatele sunt procesate în diferite moduri.
Metode de pulverizare a metalelor utilizate pentru obținerea agenților de contrast. Vaporii de metale grele (aur, platină, uraniu etc.) formați într-un dispozitiv special sub vid și temperatura ridicata, îndreptată într-un unghi acut față de preparatul care conține virus. Virușii sunt acoperiți cu un strat subțire de metal.
Metoda contrastului negativ se bazează pe faptul că, atunci când medicamentul este tratat cu unele săruri ale metalelor grele, de exemplu, cu o soluție de 1-2% de acid fosfotungstic, se creează un strat mai dens care nu transmite electroni și în care mai transparent la electroni. obiectele studiate sunt clar vizibile.
Tehnica secțiunii ultrasubțiri combinată cu îmbunătățirea negativă a contrastului este cel mai bun pentru studierea structurii fine a virionilor și studierea etapelor de interacțiune a virusurilor cu o celulă, dar în același timp este și cea mai dificilă. Bucățile examinate de țesut infectat sau alt material care conține virusuri sunt fixate într-un fixativ special (de exemplu, osmiu). Deshidratat prin plasarea secvenţială în alcooli cu putere crescătoare. Probele sunt umplute cu plastic special, după polimerizare din care se formează blocuri solide transparente. Din blocuri se prepară secțiuni ultrasubțiri cu grosimea de 10-20 nm pe un microtom special.Secțiunile rezultate se contrastează prin introducerea într-o soluție de acid fosfotungstic.
Preparate prin metodele descrise mai sus, preparatele sunt studiate într-un microscop electronic cu transmisie, a cărui rezoluție ajunge la 0,2-0,3 nm. Imaginea medicamentului este observată pe ecranul fluorescent al unui microscop electronic și sunt fotografiate plăci fotografice speciale, din care se obțin amprente. Măriri primite: ×100000-×400000.
Microscopie prin scanare electronica Se efectuează folosind un microscop electronic cu scanare, în care un fascicul subțire de electroni se deplasează rapid peste obiectul studiat, adică își scanează suprafața. Ca urmare, are loc radiația electronilor secundari care, trecând prin tubul cu raze catodice, sunt transformate într-o imagine tridimensională a obiectului pe un ecran fluorescent.
Microscopia de scanare face posibilă obținerea unei imagini tridimensionale a virionilor (anterior, preparatul este pulverizat cu metale), pentru a distinge detaliile structurii suprafeței lor, dar nu dezvăluie structura lor internă. Rezoluția microscopului de scanare este de 7-20 nm.
- Microscopie cu lumină
Într-un microscop cu lumină, puteți vedea viruși mari, ale căror dimensiuni se încadrează în rezoluția microscopului - cel puțin 0,2 microni. La fel și incluziuni intracelulare în țesuturile afectate de virus.
Virușii mari, precum poxvirusurile și incluziunile sunt detectate folosind metode speciale de colorare, în contrast de fază, într-un câmp vizual întunecat; se foloseşte şi microscopia cu fluorescenţă.
Virușii mari sunt detectați prin colorare conform Morozov (argintizare). Pentru a identifica incluziunile intracelulare, se prepară secțiuni histologice din țesuturile afectate, preparate pentru frotiu sau amprente. De obicei, preparatele sunt colorate conform Romanovsky-Giemsa, uneori prin alte metode. De cea mai mare importanță practică este detectarea incluziunilor Babes-Negri în celulele nervoase ale creierului la rabie. Pentru a face acest lucru, preparatele sunt colorate conform lui Mann.
Microscopie prin luminescență. Preparatele preparate din materiale care conțin virusuri mari, incluziuni intracelulare, acumulări de antigene virale sunt colorate cu soluții de coloranți fluorocromi. Grupuri colorate cu acridină-portocaliu de virusuri cu genom ARN și incluziunile lor sunt văzute la microscopie cu fluorescență UV ca granule roșii luminoase pe un fundal de citoplasmă celulară verde pal; Virușii genomici ADN emană o strălucire verde smarald.
Metoda imunofluorescenței pe baza combinației de virusuri, incluziuni intracelulare, acumulări de antigene virale cu anticorpi antivirali specifici marcați cu coloranți fluorocromi. Complexele rezultate dau luminescență la microscopie fluorescentă.
46. Culturi celulare și tipurile lor. Un sistem în care celulele, țesuturile sau organele îndepărtate din organism rămân viabile pentru cel puțin 24 de ore. Supraviețuitori: în care celulele își păstrează doar activitatea inerentă de viață fără reproducere. În creștere: își păstrează activitatea inerentă de viață și sunt capabile de proliferare. După natura creșterii în creștere, sunt împărțite în 3 grupe: suspensie; plasmă (culturi de bucăți fixe de țesut); un singur strat. Monostrat sunt împărțite în 4 grupe: primar tripsinizat; subculturi; semitransplantabile și interschimbabile. Suspensie: cresc sub formă de suspensii, celulele se înmulțesc cu un mediu special plus amestecare constantă folosind role. Celulele cresc pe întreaga suprafață a saltelei. Un număr mare de celule pentru vaccinuri. plasma: bucăți de țesut fixate cu plasmă, aceasta este cultura de țesut. Se obține prin fixarea unei bucăți de țesut pe paharul unui vas virusologic, apoi adăugarea mediului de groapă și cultivarea; în acest caz, creșterea celulară este înregistrată de-a lungul periferiei unei bucăți de țesut. Folosit pentru a obține bucăți de material textil. Un singur strat: pentru a indica virusul. Din țesuturi sau organe obținute prin tratarea lor cu tripsină. Subculturile se obțin din cele primare prin transplant. În continuare semitransplantat prin transplant cu mai multe coroane. Au un set diploid de cromozomi. Poate rezista la diploide în funcție de vârstă sau țesut din care a fost obținută cultura celulară. Dacă embrionul - până la 80 de zile. Adult - nu mai mult de 25 de transplanturi. Cel vechi nu are mai mult de 5. Cei transplantați sunt celule mutante și canceroase. Ele durează de un număr infinit de ori. Acestea sunt celule transformate - o tumoare canceroasă. Hela este cea mai faimoasă cultură celulară continuă din 1956. Această cultură se găsește în toate laboratoarele lumii. Este adaptat la mulți agenți patogeni. Cei care sunt perfuzați au o serie de avantaje: nu mor; rata de crestere mai mare; toate sunt la fel din punct de vedere genetic. În laborptoria, ele sunt menținute prin transferul dintr-un vas în altul.
59. CPD. Aceasta este o metodă de indicare a virusului în cultura celulară. CPD se referă la orice modificare a celulelor dintr-o cultură celulară sub influența unui virus care se înmulțește în ele. Folosesc o mărire scăzută când mă uit la stratul superior al saltelei. Celulele infectate sunt comparate cu celulele neinfectate. Diferențele pot captura întregul monostrat sau numai zone. Evaluat în crist sau puncte. Deci, dacă întregul CPD monomil a suferit o modificare, acesta este evaluat pentru 4 încrucișări; dacă ¾ - cu 3 cr; ½ pentru 2 cr; ¼ - pentru 1 cruce. Formele CPD depind de proprietățile biologice ale virusului, tipul celulei, doza de infecție, condițiile de cultură etc. Unii virusi prezinta CPD dupa 2-3 zile, altii dupa 1-2. 3 forme de cpd: fragmentare- distrugerea celulelor în fragmente separate, care sunt separate de sticlă și trec în fluidul de cultură. rotunjire- celulele își pierd capacitatea de a se atașa de sticlă, iau formă sferică, se separă și înoată liber acolo unde mor. Formarea simptomatologiei- dizolvarea membranelor celulare, în urma căreia citoplasma celulelor învecinate se îmbină, formând un singur întreg, în care se află nucleii celulari. Astfel de formațiuni sunt numite simplaste - celule polinucleare gigantice. Este necesar să se efectueze cel puțin 3 treceri oarbe pentru a aprecia prezența virusului în materialul de testat. Hemadsopțiunea - legătura dintre celulele roșii din sânge cu suprafața celulelor infectate cu virus.
51. Calculul titrului virusului după Reed și Mench. Titrarea virusului cu efect evaluabil statistic cu calculul titrului prin stuf și mench. Pentru această metodă de titrare se poate folosi orice model biologic, dar acest model trebuie să fie sensibil la virusul care este titrat (culte celulare; embrioni; animale de laborator). În funcție de efectul infecțios al modelelor biologice infectate, acestea se împart în după următoarele criterii: în funcție de recunoașterea clinică; în funcție de modificările patomorfologice; la moartea modelului; acumulare de hemaglutinină. Rezultatele muncii depind de doza de virus. S-a stabilit că doza de virus care provoacă 50% din efectul infecțios este cea mai puțin supusă fluctuațiilor și este cea mai determinată dintre toate dozele posibile. Titrul este exprimat ca o doză eficientă de 50%. Acesta este ED 50. În funcție de modelul biologic utilizat și de efectul obținut, doza de 50% poate fi exprimată în următoarele unități: LD 50 - ID 50 ELD 50 EID 50 CPD 50 este o doză citopatogenă de 50% determinată pe culturi celulare prin cpd. Dacă în sistemele infectate nu observăm 50 la sută din efectul acelor ID 50, atunci calculăm titrul după trestie și mench: lg LD 50 = lg EVA - (% ani de EVA - 50%) / (% ani de EVA - % ani de ACI) TOATE ACESTEA ESTE MULTIPLICATE CU multiplicitatea lg ori
36. Reguli și program de lucru în laboratorul de virologie. Toți elevii sunt instruiți și instruiți în metode sigure de tr. Este interzisă intrarea în spațiile de producție a persoanelor neautorizate, precum și intrarea fără halat și pantofi schimbători. Este interzisă ieșirea în afara laboratorului în halat de baie și pălărie. Fumatul, mâncatul în laborator și păstrarea alimentelor. Toate materialele care intră în laborator trebuie tratate ca infectate. La sfârșitul lucrului la locul de muncă pus în ordine și cu grijă detsensitsirovat. Etichetarea ustensilelor care conțin material infecțios. Mâinile înmănuși se spală într-un borcan cu o soluție 5% de cloramidă, apoi mănușile se scot și se dezinfectează pentru a treia oară, se dezinfectează și se spală. ra Activitatea virologului laboratorului se bazează pe trei principii principale: a preveni infectarea angajaților sau a persoanelor care lucrează cu materiale care conțin viruși. Pentru a preveni contaminarea materialului (uneltele, vasele sunt sterile) curățarea spațiilor cu o soluție dezinfectantă + lămpi UV. Preveniți îndepărtarea virusului în afara laboratorului (cu aer, ustensile, material solid și lichid). Pipetele, paharele trebuie aruncate în sterilizator. Eprubete cu viruși, țesuturi - într-o autoclavă. Nu deschideți centrifuga până nu se oprește. Scoateți aerul din seringă numai într-un tampon de bumbac cu alcool 75%. Este interzisă ventilarea încăperii cu un sistem de ventilație cu filtru.
37. Măsuri de siguranță în cazul materialelor care conțin virusuri. Evitați răspândirea virușilor în mediul extern. Preveniți contaminarea (contaminarea) materialului care conține virusuri cu microfloră străină. Asigurați siguranța personală. Pentru a respecta aceste cerințe, sunt necesare următoarele reguli de lucru: să fii atent, colectat și precis; să fie doar în halat și să schimbe hainele într-un dulap; se lucrează numai cu manșete cu nasturi la pălărie și mască de tifon; respectați cu strictețe curățenia și ordinea în laborator; nu ar trebui să existe obiecte străine pe desktop; fumatul și mâncatul sunt interzise. Folosiți unelte și ustensile sterile. Lucrați cu vase în apropierea flăcării arzătorului. Nu-ți pune degetele în gură. Deșeuri de dispozitive în sterilizator. Colectați pipetele folosite într-un vas cu soluție dezinfectantă. Colectați deșeurile solide sau lichide (vată) în recipiente speciale pentru dezinfecția ulterioară. Nu turnați deșeurile în chiuvete sau toalete.
33. Mecanismul acțiunii antivirale a interferonului. Interferonul nu are efect direct asupra virusului. Afectează doar celula prin activarea sintezei anumitor enzime celulare. În special, enzima protein kinaza și 2,5 oligosintetaza. Informațiile despre sinteza acestor enzime se află, de asemenea, în anumite părți ale genelor celulei și sunt, de asemenea, într-o stare represivă. Sub interfecțiunea aerului are loc dereprimarea genelor responsabile de sinteza protein kinazei și sintetazei 2,5 sau goA. Și sinteza lor crește brusc. 1) sub aerul proteinei kinazei, factorul de inițiere este fosforizat, ceea ce asigură legarea la ribozomul ARN-ului mesager viral. Astfel, ARN-ul mesager viral nu se poate lega la aparatul ribozomal al celulei, adică la începutul translației. Și în cele din urmă, sinteza proteinelor și enzimelor virale devine imposibilă. 2) sub influența interferonului se activează sinteza 2,5 oligoA sintetazei, care catalizează sinteza acidului 2,5 oligoAdenilic în celulă. Acest acid schimbă acțiunea nucleazelor celulare asupra distrugerii ARN-ului mesager viral. Astfel, sub influența interferonului apare: blocarea translației ARN-ului mesager viral; distrugerea ARN-ului mesager viral. Efectul inhibitor al interferonului asupra reproducerii celulare: interferonul la o concentrație de la 0 la 1000 de unități pe ml inhibă multiplicarea unei largi varietati de celule în orice țesut. Interferonul reglează creșterea multor tipuri de celule, inclusiv culturile de celule primare, celulele tumorale. Baza este suprimarea sintezei anumitor proteine celulare și sinteza de noi proteine de către interferon. Inter crește activitatea ucigașă a limfocitelor T. În doze mari, formarea de anticorpi este inhibată. Dozele mici, dimpotrivă, stimulează formarea de anticorpi. Krailing - cuști prelucrate doze mici interf form mai mult intr decat brut. Doze prea mari - procesul invers.
35. Tipuri de interacțiune a virusului cu celula. Productiv și abortiv. Productiv este împărțit în litic și latent. Productiv: acesta este un tip de mutuală în care se formează o nouă generație de virion în celulă. Dacă celula moare rapid după imaginile noului virion pok, atunci aceasta este o cale litică productivă pentru interacțiunea virusului cu celulele. dacă celula în care dimensiunea virusului pentru o lungă perioadă de timp își păstrează viabilitatea (prin înmugurire), atunci acesta este un produs al unui tip latent de interacțiune. Avortiv: acesta este un tip de mutuală în care reproducerea virionilor se oprește în orice stadiu, vir inf nu se dezvoltă. Ca urmare a interacțiunii virusului cu celula, în celulă pot apărea următoarele modificări: degenerarea celulară- celulele transforma mai intai o forma neregulata, apoi rotunda, apare granularitatea in citoplasma, apoi fragmentarea nucleului, apoi moartea celulara. Astfel de modificări se numesc CPD. În încrucișări: 4 încrucișări - 100% cpd. Formarea simptomatologiei- celule multinucleate. Formarea corpurilor de incluziune- mb intranucleare si plasma, continand ARN sau ADN. Transformarea celulelor virusuri oncogene (retrovirusuri ARN). Reproducerea în celula a virusurilor oncogene nu este însoțită de CPD. Celula produce un virus continuu. Sinteza interferonului.
4. Rezistenta virusurilor la factorii fizici si chimici. Rezistența virusurilor animale este relativ bine studiată atunci când sunt expuși la factori externi: tempo, radiații, ultrafiol, ultrasunete, pH, formol, fenol etc. Pentru a proteja împotriva acestor efecte, virionii au o înveliș proteic. Structura și compoziția chimică diferită a învelișurilor proteice determină rezistența inegală a virusurilor. În funcție de aceste caracteristici, același factor poate distruge complet unii virioni și nu pe alții. De exemplu, solvenții organici: acei virioni în învelișul cărora nu există lipide sunt rezistenți la aceste substanțe, iar cei care conțin lipide sunt distruși rapid. Inactivarea virusurilor înseamnă pierderea completă sau parțială a activității lor biologice, care are loc ca urmare a acțiunii factorilor fizico-chimici. Odată cu o schimbare a nucleilor virali ai acizilor și proteinelor, are loc inactivarea completă, adică pierderea tuturor proprietăților biologice ale virusului - își pierde numai proprietățile infecțioase și își păstrează imunogenitatea. Natura si gradul agentilor de natura chimico-fizica care actioneaza asupra virusului depind de natura factorului de inactivare, de doza, timp indelungat, de tipul virusului. Atunci când virusul este inactivat, poate avea loc fie scindarea proteinelor învelișului, urmată de dezintegrarea acestuia în unități separate, fie compactarea proteinelor menținând în același timp structura generală a învelișului. Clivajul se observa sub actiunea unui mediu acid si alcalin cu incalzire prelungita si slaba.Coagularea si compactarea are loc atunci cand sunt expuse la formaldehida, temperatura ridicata sau fenol. Depinde de concentrare și durată. Astfel, în unele cazuri, coagularea proteinelor obol este însoțită de distrugerea nucleelor de acizi, iar virusul suferă o pierdere ireversibilă a infecțiozității. În alte cazuri, capacitatea virusului de a se reproduce este păstrată. Conservat cu glicerina.
60. PCR. Principiul metodei: se identifică o genă specifică pentru un anumit virus - o secțiune a unei molecule de ADN care poartă informații pentru sinteza unei proteine. Această genă este apoi identificată în materialul de testat prin PCR. Această reacție vă permite să formați copii suplimentare ale genei - pentru a amplifica o secțiune de ADN într-o eprubetă. În funcție de scopul studiului, este posibil să se identifice specia sau genul de mo. Esența PCR: o moleculă de ADN este încălzită la 90-94 de grade. Ceea ce duce la distrugerea legăturilor de hidrogen dintre bazele azotate ale dublei helix și apoi răcit la 52 g în prezența enzimei ADN polimerază. Creșterea ulterioară a ratei duce la sinteza unei noi molecule de ADN - un șablon complementar. Această procedură se repetă de multe ori, drept urmare fragmentele cresc. Indicarea se realizează folosind electroforeză sau o sondă ADN marcată. Componente principale: ADN polimerază termostabilă; oligonucleotidă de 20 de nucleotide; trifosfați; amplificator, vase și reactivi pentru electroforeză în gel de agaroză. Stadializare: obținerea unei probe de ADN. Pentru a face acest lucru, materialul de testat este suspendat într-un tampon sau apă distilată. S-a adăugat OH de sodiu şi s-a păstrat timp de 7 minute. Amestecul este neutralizat. Lizatul este centrifugat timp de 10 minute pentru a precipita particulele mari.Supernatantul este utilizat pentru a stabili PCR. Pcr - amplificarea unui fragment de genă dat de ADN. Apoi s-a topit în amplificator timp de 3 ore. Indicație de amplificare - proba este supusă electroforezei pe gel de agaroză pentru a separa ADN-ul. După 30 de minute, agaroza este polimerizată în aparat și se formează godeuri în agaroză. luați 10 µl din amestec și amestecați cu 5 µl de colorant. Amestecul se adaugă în godeuri și se efectuează electroforeza timp de 40 de minute. Placa este îndepărtată și colorată timp de 10 minute într-o soluție de bromură. Agaroza este apoi plasată pe un transiluminator și modelele de benzi obținute sunt fotografiate. Benzile dezvăluite de ultraradiere sunt fragmente de ADN.
49. Metoda de infectare a culturilor celulare. Indicarea virusurilor în culturi celulare. Infecție: pentru aceasta se selectează eprubete cu un monostrat celular continuu. Mediul de creștere este drenat, celulele sunt spălate de câteva ori cu soluție Hank. În fiecare tub se adaugă 0,2 - 0,1 ml de material viral și se distribuie uniform pe întregul strat de celule prin agitare. În această formă, tuburile sunt lăsate timp de 1 până la 2 ore la 22 sau 37 de grade pentru adsorbția virusului pe suprafața celulei. Apoi materialul viral este îndepărtat din tuburi și mediul de sprijin este turnat în tub 1-2 ml. monostratul de celule după izolarea virusului este spălat de 2 ori cu soluție Hank și apoi turnat în mediu suport. Indicaţie: conform DPC; RGAd; prin formarea de plăci; incluziuni intracelulare; RECIF; microscopia electronică
54. RTGA. RGA. Rtga: esență- când virusul este amestecat cu un ser special, virusul își pierde proprietățile hemaglutinante. Goluri– identificarea virusului izolat; detectarea anticorpilor în serul de testat și titrul acestora. Componente- pentru serovariant direct: material care contine virus, ser specific, suspensie 1% de eritrocite, solutie salina pentru diluare. Pentru retrospectivă - serul de testare, antigenul standard într-o anumită doză de 4 HAU (titrul diluției virusului) 4 HAU - 1:32. Sistem– la fiecare diluție de ser se adaugă un volum egal de antigen (virus) standard în doză de 4 AEE. Contact 30 de minute la temperatura camerei. În fiecare godeu cu diluții de ser și o doză constantă de virus în 4 ha, se adaugă un volum egal de suspensie de eritrocite. Contact 30-60 min la temperatura camerei. Contabilitate reacţiile se desfăşoară în cristae. dacă plus, atunci nu există aglutinare, dacă minute, atunci hemaglutinare. Titrul de anticorpi din serul de testat este diluția maximă a serului care întârzie complet aglutinarea eritrocitelor.RGA: esență: în adsorbția virusului pe suprafața eritrocitei, ceea ce duce la lipire. Scopuri: indicare; pentru titrarea virusului în Gaen. Componente: virus; 0,5 suspensie de eritrocite; soluție salină pentru preparare. Post de schemă: pregătiți o diluție de două ori a virusului; pentru fiecare răspândire a virusului, se adaugă un volum egal de 0,5% suspensie de eritrocite; contact 30-60 minute la temperatura camerei. Contabilitate: in crist. 4 criste - 100% aglutinare. 3 crist - 75%. 1 încrucișare - aglutinare. 1 gaen este diluția maximă a virusului capabilă să provoace aglutinarea a 50% din eritrocite.
57. ELISA. Esență: la legarea antigenului + serul marcat, enzima descompune substratul. Un complex antigen + conjugat se formează cu formarea unui produs de reacție colorat, care este evaluat la microscop cu lumină sau vizual. Scop: identificare. Componente: material de gazon viral, conjugat, substrat. Schema de stadializare: culitrul celulelor se fixează cu acetonă răcită. Se usucă și se pune pe ele conjugate. 1-2 ore incubate într-un ritm de 37 g într-o cameră umedă. Clătiți cu soluție salină, clătiți distilat cu apă și uscați. Se aplică câteva picături dintr-o soluție de substrat, se incubează timp de 5-10 minute, apoi se spală în soluție salină și se clătește cu apă. Contabilitate: în cazul în care, adică în prezența unui antigen, după aplicarea conjugatului, se formează un complex de antigen plus anticorp marcat cu o enzimă. După aplicarea substratului, acesta se descompune prin acțiunea enzimei, formând un produs colorat care este clar vizibil la microscopul optic.
56. RSK. Concluzia: în legarea unui compliment la complexul antigen plus anticorp. Absența unui compliment gratuit în acest sistem este apreciată de reținerea hemolizinei în sistemul indicator. Obiective: identificare; detectarea anticorpilor și a titrului acestora în serul sanguin studiat. Componente: 2 sisteme - 1) (material care contine virus; ser specific;) (ser testat; antigen standard). 2) sistem hemolitic (indicator) - 2-3% suspensie de eritrocite de oaie este un antigen; hemolizina (ser hemolitic) este un anticorp. Anticorpii corespund unui antigen. Și un compliment pentru o singură reacție: dacă la prima, atunci va exista o întârziere a hemolizei când complimentul va contacta sistemul studiat. Dacă în a doua, atunci eritrocitele sunt lizate, va avea loc hemoliză completă. Schema de setare: reacția este introdusă mai întâi în sistemul studiat, apoi se adaugă un sistem indicator în aceeași eprubetă. Contabilitate: RSK pozitiv - intarziere hemoliza. Negativ - hemoliză completă.
7. Proteine virale. Format din aminoacizi. Compoziția proteinei virale depinde de secvența de aminoacizi; această ordine este determinată de informațiile genetice codificate în genomul viral. Proteinele virale sunt împărțite în structurale și nestructurale. Proteinele structurale fac parte din virionii maturi. B non-structurale nu fac parte din virionii maturi, dar sunt obligatorii în anumite stadii de reproducere. StructuralNestructurale
8. Enzime virale. Sunt de natură proteică. Ele pot fi conectate direct la virion, iar mb nu sunt conectate - nu sunt structurale. la DNA Pentru ARN: ADN-polimirază dependentă de ARN - nu este prezentă în celulă, este necesară pentru „-” care conține ARN și ADN, care conține în familia retroviridelor vir, enzima care transhibează genomul viral se numește ADN-polimirază dependentă de ARN. Această enzimă are denumiri: revers transcriptază, revers transcriptază. Enzime implicate în formarea proteinelor virale: proteaze, protein kenaze.
52. RN.Esență: Când un virus interacționează cu un anumit ser, virusul își pierde proprietățile infecțioase, adică capacitatea de a se multiplica în celule. Obiective: identificarea virusului izolat, detectarea anticorpilor în serul sanguin și titrul de anticorpi. Componente: material care conține virus, ser specific, model biologic. Dacă este retroactiv: ser de testare, antigen standard, model biologic. Schema generală de setare: antigenul si anticorpul se amesteca, contact 30-40 minute, maxim 2 ore la temperatura de 37-38 grade; un amestec de antigen plus anticorp infectează un model biologic; observatie si contabilitate. Contabilitate: pH pozitiv - viu, negativ - mort.
53. RDP.Esență: antigenul și anticorpul cu același nume plasate la aceeași distanță unul de celălalt în gelul de agar difuzează unul spre celălalt, formând un precipitat sub formă de bandă albă la punctul de întâlnire. Obiective: identificarea virusului izolat, detectarea anticorpilor în serul de testat. Componente: material care conține virus, ser specific, gel de agar. Pentru retrospectivă: test de ser sanguin, antigen standard, gel de agar. Schema de setari: acoperirile cu agar se prepară pe o lamă de sticlă, se prepară godeurile, componentele de reacție se adaugă în godeuri conform unei anumite scheme, sticla cu reacția este plasată într-un termostat la 37-38 C. Contabilizarea reacției după 48 de ore. O reacție pozitivă este formarea unei benzi albe de precipitare.
55. RGAd, RTGAd. RGAd: Esență:în adsorbția eritrocitelor pe suprafața celulelor infectate cu virus. Obiective: indicație de virus. Componente: cultura celulară infectată cu material care conține virus; suspensie eritrocitară . Schema de setari: preinfectează o cultură celulară cu un singur strat cu materialul de testat. Culturile sunt drenate în mediu de groapă suport. S-a spălat cu soluția lui Hank. Faceți o suspensie de eritrocite. Contact 5-15 minute la temperatura camerei. Contabilitate: efectuată la microscop cu lumină. Pozitiv - eritrocitele sunt adsorbite pe celule; negativ - eritrocitele plutesc liber. RTGAd: esență: în legarea anticorpilor specifici la suprafața celulelor infectate cu virus, ceea ce duce la inhibarea adsorbției pe celulele eritrocitare. Obiective: identificarea virusului izolat. Componente: cultura de celule infectate; ser specific; suspensie de eritrocite. Schema de setari: preinfectează o cultură celulară cu un singur strat cu un material inițial care conține virusul într-un singur strat. Se scurge în mediu suport și se adaugă 0,8 ml de ser specific. Contact 20-30 minute. Adăugați o suspensie de eritrocite. Contact 5 - 15 minute. Contabilitate: pentru control pune neapărat RGA. Contabilitatea în eprubete experimentale: pozitiv - eritrocitele sunt libere, negative - eritrocitele sunt, de asemenea, libere. Contabilitate în tubul de control la pozitiv - adsorbție, negativ - plutește liber.
6. Acizi nucleici virali.+ ARN este un nucleu viral de acizi care au funcția și ARN informatic. Informațiile despre proteina sistemului de sinteză din ARN + sunt transmise imediat la ARN-ul genomic fără transcripție. -Virușii care conțin ARN sunt virusuri cu - ARN monocatenar care nu are funcția de ARN mesager, în astfel de virusuri sinteza ARN mesager (transcripția) are loc pe șablon minus catenele de ARN genomic folosind îndeaproape o enzimă specifică virusului. asociat cu ARN gnom, ARN-polimirază dependentă de ARN. Există viruși care conțin atât catenele de ARN plus cât și minus, acestea includ adenovirusuri, paramixovirusuri. Informațiile genomice din ADN-ul dublu catenar sunt codificate pe ambele catene.Acizii nucleici sunt reprezentați de polinucleotide formate din nucleotide individuale. Numărul lor în acizi nucleici este diferit. Fiecare nucleotidă constă din 3 subunități: un reziduu de acid fosforic, un carbohidrat și o bază azotată.
9. Structura virusurilor. Forme de bază. Tipuri de simetrie. Structura: ADN: mai des dublu catenar, informațiile despre gene sunt codificate pe ambele catene. ADN-ul viral poate fi aranjat într-o manieră liniară, circulară. Poate fi monocatenar. ARN viral: mai des monocatenar, mai rar două. Ele sunt situate liniar, în mod inelar, fragmentate. De regulă, ele constau din 11-12 fragmente. ARN-urile vir monocatenare pot fi de două tipuri: ARN-uri plus și minus catene (genom negativ).Tipuri de simetrie: dispunerea subunităților proteice (caposmere) determină tipul de simetrie a virionului - elicoidal, cubic, combinat. Spirală Acesta este un tip de sim în care capsomerele sunt aranjate într-un model elicoidal în jurul nucleului acid. Virușii mari și unii viruși de dimensiuni medii au acest tip de Sim. Forma: în formă de tijă, polividă, sferică, formă ovală. La virusurile în formă de tijă, capsida este formată din capsomere stivuite în jurul nucleului acid în spirale elicoidale de același diametru apropiate unele de altele.La virusurile sferice, capsomerii sunt stivuite în spirală, dar cu diametre diferite. Tip cubic: majoritatea virusurilor mici și o proporție semnificativă a virusurilor de talie medie o au. Forma unor astfel de viruși este sferică. Capsomerele capsidelor sunt localizate în jurul nucleului acid ca în jurul unui corp izometric obișnuit. învelișul proteic al unor astfel de viruși se apropie de forma unui icosider - o față obișnuită cu 20 de fețe. Combinate tip de simetrie: este format din spirală și cubic. Toți fagii și unii virusuri complexe din familia coxviridae îl au. Au o înveliș exterioară într-un mod cubic, capside în mod spiralat. Fagii au un cap icosendric și un proces spiralat.
18. Principalele etape ale primei faze a reproducerii virusului. Aceasta este faza de infectare a celulei, in aceasta faza virionul trebuie sa intre in contact cu celula, sa patrunda in celula si sa se dezbrace. Primul stadiul de adsorbție a virionilor pe suprafața celulei se poate produce în două moduri: fizico-chimic (nespecific); receptor (specific). Calea fizico-chimică este determinată de interacțiunea forțelor electrostatice de suprafață care apar între grupurile de proteine virale încărcate pozitiv și grupările de carboxine, sulfat și fosfat încărcate negativ ale peretelui celular. Receptorul se bazează pe interacțiunea specifică a receptorului proteic viral cu receptorii complementari de pe suprafața peretelui celular. Receptorii de virus și receptorii sensibili la acest virus celulele au o configurație complementară (cum ar fi cheia unei încuietori). Dacă celula nu este sensibilă, atunci reabsorbția nu va avea loc niciodată. Al doilea penetrarea - pentru diferiți virusuri se produce în moduri diferite: cu ajutorul viropexisului; prin topirea scoicilor. Viropexis Această cale este similară cu pinocitoza. Mai întâi, la locul de adsorbție pe suprafața celulei, peretele celular al membranei se invaginează, apoi marginile membranei se contopesc cu interiorul celulei în vacuola celulară, se găsește virionul cu toate învelișurile sale. cale fuziune- în acest caz, părțile învelișului viral și ale membranei celulare care se acceptă reciproc sunt topite sub acțiunea enzimelor specifice virusului și doar acidul nucleic viral apare în celulă, în timp ce resturile virusului sunt încorporate în celulă. membrana celulara. Al treilea etapă- deprotenizarea - eliberarea din membrane - depinde de modurile in care virusul patrunde in celula. Dacă, prin fuzionarea cochiliilor, atunci deprotonizarea ca etapă separată nu este izolată, atunci are loc concomitent cu pătrunderea virusului. Dacă pătrunderea prin viropexis, atunci eliberarea nucleului viral din membranele acide începe după distrugerea proteinelor, lipidelor, grăsimilor care alcătuiesc membranele virale. Toate etapele depind de temperatură.
20. Transcriere. Aceasta este rescrierea informațiilor genetice de la acizii nucleici virali în ARN-ul informațional viral nou sintetizat, în conformitate cu legile codului genetic. (virusul trebuie să prezinte proteina celulei sintetizate, să fie convertit în ARN). Produs final transcriere - ARN mesager viral. Transcrierile ARN monocatenar + sunt absente, în timp ce ARN-ul lor viral genomic are ARN viral informativ. În ARN-urile monocatenar, genomul nu poate funcționa ca ARN mesager și ARN-ul său este transhibat de enzima specifică virusului ARN-polimiraza dependentă de ARN. IMAGINE!
21. Difuzare. Acesta este procesul de traducere a informațiilor genetice conținute în ARN-ul mesager viral într-o anumită secvență de aminoacizi. O translație are loc atunci când patru baze sunt legate în ARN-ul mesager viral la un cod de 20 de aminoacizi. Produsul final al traducerii sunt proteinele virale. Sinteza proteinelor - pe ribozomii celulei. Constă din 3 faze: inițierea traducerii și începerea traducerii; continuare; terminare - sfârșitul unei emisiuni. Inițierea se bazează pe formarea unui complex de componente necesare începerii translației, adică complexul de inițiere cu se bazează, de asemenea, pe recunoașterea ribozomului ARN mesager viral și legarea acestuia de anumite zone numite capac. Aceasta este guanina metilata. După ce a recunoscut capacul, ribozomul alunecă în jos pe molecula de ARN mesager până ajunge la locul unde începe decodificarea informațiilor.
5. Compoziția chimică a virusurilor. Virușii sunt formați din acizi nucleici (ADN, ARN). Acizii nucleici sunt reprezentați de polinucleotide formate din neucleotide individuale. Fiecare nucleotidă constă din 3 subunități: un reziduu de acid fosforic, un carbohidrat și o bază azotată. Proteine virale : Compus din aminoacizi. Compoziția proteinei virale depinde de secvența aminoacizilor; această ordine este determinată de informațiile genetice codificate în genomul viral. Proteinele virale sunt împărțite în structurale și nestructurale. Proteinele structurale fac parte din virionii maturi. B non-structurale nu fac parte din virionii maturi, dar sunt obligatorii în anumite stadii de reproducere. Structural proteinele virale sunt împărțite în funcție de localizarea în virion în grupul de urme: proteine capside - în capside; supercapsid b - în supercapsid (cea mai mare parte a proteinei, există și grăsimi și carbohidrați); proteinele matricei - proteine ale stratului membranar; proteinele miezului viral sunt enzime. Nestructurale- în funcţie de funcţiile pe care le îndeplinesc, se împart în: regulator de expresie a genomului viral; inhibitori ai biosintezei celulare; inductori de distrugere a celulelor; precursori ai proteinelor virale structurale ale proteinelor vir; unele enzime virale nu fac parte din virionii maturi. Lipide: sunt în principal parte din învelișul supercapside al virionului în virusurile complexe. Toate acestea nu sunt codificate de genomul vir și sunt de origine celulară. Sunt reprezentate de fosfolipide, glicolipide. Carbohidrați: fac parte din obolul supercapside, nu sunt codificate de genomul viral și sunt de origine celulară, sunt reprezentate de glicoproteine și glicolipide . Enzime virale: Sunt de natură proteică. Ele pot fi conectate direct la virion, iar mb nu sunt conectate - nu sunt structurale. Enzimele polimerazele timpurii și replicazele timpurii participă la etapa de schimbare a informațiilor. Ele aparțin inhibitorilor biosintezei celulare. Enzime care transhibează genomul viral: la DNA care conțin viruși - există ARN polimerază dependentă de ADN în celulă, în unele cazuri este disponibilă pentru viruși, în unele nu este. Poate fi atât de origine celulară, cât și virală. În virusurile care conțin ADN, reproducerea în nucleu este de origine celulară. În citoplasmă - origine virală - specifică virusului.
Pentru ARN: ADN-polimirază dependentă de ARN - nu este prezentă în celulă, este necesară pentru „-” care conține ARN și ADN, care conține în familia retroviridelor vir, enzima care transhibează genomul viral se numește ADN-polimirază dependentă de ARN. Această enzimă are denumiri: revers transcriptază, revers transcriptază. Enzime implicate în formarea proteinelor virale: proteaze, protein kenaze.
13. Bacteriofagi. Virusul bacteriilor. Sunt cunoscuți bacteriofagi ADN și ARN. Majoritatea ADN-ului fagilor este dublu catenar. Fagii ARN sunt monocatenar. Acidul nucleic al fagului este înconjurat de o capsidă poliedrică (cap), de care este atașat un proces (coada) la mulți fagi. Diametrul capetelor este de aproximativ 60-95 nm iar lungimea proceselor este de 250 nm cu o grosime de 10-25 nm. Apendicele servește ca structură de atașare la bacterie. Interacțiunea dintre b și celulele microbiene este un proces biologic complex, al cărui rezultat depinde de proprietățile fagilor și se manifestă prin liza celulelor bacteriene. bacteriofagii sunt folosiți pentru diagnosticare (antrax); pentru tratamentul inf bacterian; pentru prevenirea inf (salmoneloza). IMAGINE!
22. Replicarea ADN-ului viral.
23. Replicarea ARN viral. ARN monocatenar cu genom negativ:
25. Asamblarea virionilor și eliberarea lor din celulă.
: explozie petem, ruptura, distrugerea celulei in care s-au format virionii maturi (virusuri aranjate simplu), celula moare. Cele complicate ies prin înmugurire, adică trec prin peretele celular, se desprind. În acest caz, celula nu moare imediat, ci atunci când rezervele sale sunt epuizate.
19. Faza a doua a reproducerii.Etapa eclipsei: stadiul de schimbare a informațiilor. În această etapă, funcția genomului celular este suprimată datorită faptului că eliberarea blocurilor de acid nucleic și a enzimelor virale blochează aparatul genetic al celulei și sistemele de sinteză ale celulei. Acest lucru duce la faptul că celula oprește reproducerea propriilor componente celulare și este rearanjată pentru a reproduce componentele vyrus. Replicasele timpurii și polimirazele timpurii sunt implicate aici. Transcriere: Aceasta este rescrierea informațiilor genetice de la acizii nucleici virali în ARN-ul informațional viral nou sintetizat, în conformitate cu legile codului genetic. (virusul trebuie să prezinte proteina celulei sintetizate, să fie convertit în ARN). Produsul final al transcripției este ARN-ul mesager viral. Transcrierile ARN monocatenar + sunt absente, în timp ce ARN-ul lor viral genomic are ARN viral informativ. În ARN-urile monocatenar, genomul nu poate funcționa ca ARN mesager, iar ARN-ul său este transhibat de enzima specifică virusului ARN-polimiraza dependentă de ARN. IMAGINE!Difuzare: Acesta este procesul de traducere a informațiilor genetice conținute în ARN-ul mesager viral într-o anumită secvență de aminoacizi. O translație are loc atunci când patru baze sunt legate în ARN-ul mesager viral la un cod de 20 de aminoacizi. Produsul final al traducerii sunt proteinele virale. Sinteza proteinelor - pe ribozomii celulei. Constă din 3 faze: inițierea traducerii și începerea traducerii; continuare; terminare - sfârșitul unei emisiuni. Inițierea se bazează pe formarea unui complex de componente necesare începerii translației, adică complexul de inițiere cu se bazează, de asemenea, pe recunoașterea ribozomului ARN mesager viral și legarea acestuia de anumite zone numite capac. Aceasta este guanina metilata. După ce a recunoscut capacul, ribozomul alunecă în jos pe molecula de ARN mesager până ajunge la locul unde începe decodificarea informațiilor. Replicarea ADN-ului viral: Replicarea a două ADN elicoidal: o moleculă de ADN dublu catenar este mai întâi separată în 2 catene separate cu ajutorul enzimelor nucleaze celulare, apoi pe una dintre catenele ADN-ului viral din care se formează ADN-ul informațional viral sub formă de matrice. Acest lucru se întâmplă cu ajutorul unei ARN polimeraze dependente de ADN-ul unei enzime celulare specifice virusului. Apoi, ARN-ul informator viral se deplasează în ribozomul celulei unde are loc translația cu formarea de proteine și enzime virale, inclusiv enzima ADN polimerază. Cu ajutorul ADN polimerazei, oa doua catenă complementară de ADN este construită din nucleotidele celulei. Astfel, sunt sintetizate noi molecule de ADN dublu catenar. Replicarea ADN-ului monocatenar: Catenele simple de ADN au polaritate pozitivă. Cu ajutorul enzimei ADN-polimerazei dependente de ADN-uri specifice virusului, se formează o catenă ADN complementară minus pe șablonul ADN monocatenar viral. Se sintetizează o structură cu dublu helix, care se numește formă replicativă. Catenele plus de ADN monocatenar sunt apoi formate pe matricea catenelor minus ale formei replicative prin deplasarea catenelor plus de ADN din forma replicativă. Replicarea ARN-urilor virale: ARN-uri monocatenar cu genom negativ: imediat după pătrunderea în celulă, transcripția are loc cu formarea de ARN inf viral plus. La aceasta ia parte enzima specifică virusului ARN-polimeraza dependentă de ARN. Apoi ARN-ul vir inf este tradus pentru a forma proteine și enzima ARN polimeraza. Ulterior, cu ajutorul ARN polimerazei, pe matrice se formează catenele fiice monocatenar minus ARN plus catenele informaționale de ARN. ARN monocatenar cu genom pozitiv: după ce intră în celulă, plus ARN-ul se leagă imediat de ribozomi unde este tradus pentru a forma proteine și o enzimă, inclusiv enzima ARN replicaza. Apoi, sub acțiunea ARN replicazei, se formează o formă replicativă. Pe matricea minus ARN a formei replicative, imaginea plus catenele de ARN prin deplasarea lor din forma replicativă. Replicarea ARN viral dublu catenar: sinteza ARN-urilor virale mesager are loc pe un model de ARN dublu catenar folosind enzima ARN polimeraza dependentă de ARN. Transcriere pe un șablon de catenă de ARN Fiecare fragment este transcris separat. Apoi sunt traduse cu formarea proteinelor și a enzimei ARN polimeraza, cu ajutorul acestei enzime, pe catenele plus de ARN mesager, ele formează catenele mins complementare de ARN, adică ARN bicatenar. Asamblarea virionilor și eliberarea lor din celulă: 2 strategii de asamblare, maturare si iesire din celula infectata: implementarea asamblarii si maturarii in interiorul celulelor; combinarea ultimei etape de asamblare a virionului cu iesirea din celula infectata.
Asamblarea se realizează prin agregare simplă, adică asocierea proteinei vir cu nucleoacidul are loc sub influența factorilor fizico-chimici, adică se realizează auto-asamblarea. Se bazează pe unificare și recunoaștere specifică non-proteică și proteină-acid nucleic. Se formează nucleocapsidul. Pentru virușii pur și simplu aranjați, aici se termină procesul de auto-asamblare. În virușii complexi, procesul de auto-susținere a fost efectuat diferit. O parte din proteină merge la formarea nucleocapsidei, care se formează ca în virușii simpli, iar o parte din proteine se deplasează în membrana celulară. Nucleocapsidul format se deplasează ulterior acolo. Și formarea învelișului supercapside are loc atunci când virionul iese din celulă, adică nucleocapsidul este acoperit de sus cu proteine care s-au mutat în membrana celulară, iar la părăsirea acestei învelișuri exterioare, grăsimile și carbohidrații din celulă sunt încorporate. . Există două moduri de a ieși: explozie petem, ruptura, distrugerea celulei in care s-au format virionii maturi (virusuri aranjate simplu), celula moare. Cele complicate ies prin înmugurire, adică trec prin peretele celular, se desprind. În acest caz, celula nu moare imediat, ci atunci când rezervele sale sunt epuizate.
62-63. Variolă de oi și capre(genul Caprippoxvirus). Ectima contagioasă la oi și capre(genul Parapoxvirus).Familie: poxviridae. conţinând ADN. Caracteristici ale reproducerii: genomul virusului este foarte mare.Chiar și în celulele infectate, replicarea este finalizată după 6 ore. Penetrarea are loc prin fuziunea membranelor virale și celulare. După penetrare, ADN-ul dublu catenar este scindat și replicarea începe imediat pe ambele catene de ADN. Mai mult, sinteza componentelor virale are loc în citoplasma celulelor. Asamblarea virionului în citoplasmă. Ieși prin înmugurire.
2. Rolul virusurilor în patologia infecțioasă a animalelor. În prezent, bolile virale sunt de mare importanță în patologia infecțioasă a animalelor, oamenilor și plantelor. Rolul lor crește odată cu reducerea și eliminarea bolilor bacteriene, micotice și protozoare. Bolile virale reprezintă aproximativ 80% în medicină și 50% în medicina veterinară. Se știe că peste 500 de boli sunt cauzate de viruși. Originea virală a fost stabilită în astfel de boli deosebit de periculoase precum febra aftoasă, pesta bovină, pesta porcină etc. Virologia poate fi împărțită în general și particular. Studiază general natura și originea virusurilor, clasificarea, structura și compoziție chimică, genetică și selecție, metode de diagnostic și prevenire, bazele imunității antivirale. Private vir studiază numele și poziția sistematică a agenților patogeni specifici, structura, dimensiunea și rezistența virionului, terapie, metode de diagnostic și prevenire.
1. Istoria dezvoltării. Prima perioadă începe din cele mai vechi timpuri până în 1892. În această perioadă, virologia ca știință independentă nu a existat. Studiul bolilor cu etiologie necunoscută a fost efectuat de bacteriologi. A doua perioadă - formarea virologiei ca știință independentă - acoperă 1892-1950. această perioadă a început odată cu descoperirea botanistului rus D.I. Ivanovsky (1898) despre filtratul agentului cauzal al bolii mozaic de tutun. Ivanovsky, studiind etiologia bolii tutunului, a descoperit că această boală este cauzată de un microorganism special, cel mai mic, care trece prin filtrele bacteriene. Este invizibil la microscopul optic. Nu crește pe mediu de groapă artificială. Mai târziu, m.o. similare au fost izolate de la alte plante, precum și de la animale și oameni. Au fost uniți într-un grup independent - ultravirusuri. În anii 1930, embrionii de pui au început să fie utilizați în practica virologică. În 1956, Stanley a reușit să împartă virusul în componentele sale principale - proteine și acid nucleic. La sfârșitul anilor 40 ai secolului al XX-lea, crearea micr electronic Rudenberg. Iar lumina a fost creată de Leeuwenhoek. Oamenii de știință sovietici care au contribuit la virologie: Jdanov, Likhachev, Syurin.
48. Metodă de obținere a culturilor celulare primare tripsinizate monostrat. Celulele cu un singur strat sunt necesare pentru a indica virusurile. Se obține din țesuturi sau organe prin tratarea acestora cu tripsină. Monostraturile sunt împărțite în 4 grupe: tripsinizatori primari; subculturi; diploide sau semitransplantate; împletite. Țesutul este zdrobit și dispersat cu o enzimă - tripsina. Apoi, tripsina este îndepărtată prin centrifugare și se adaugă o anumită cantitate de mediu nutritiv lichid în sedimentul rezultat. Celulele sunt crescute sub forma unui singur strat - un monostrat pe suprafața interioară a sticlei. Nevoia constantă de organe de la animale sănătoase. ȘI Utilizați embrioni 9-112 zile. Ovoscopia. Prelucrare Shell. Foarfecele taie coaja deasupra marginii pugului. Embrionul este îndepărtat steril. S-a spălat cu soluția lui Hank. Pregătiți o pungă musculo-scheletică. S-a spălat cu soluția lui Hank. Țesătura este tăiată cu foarfece. Se transferă într-un balon de tripsinizare. Balonul a fost plasat pe un agitator magnetic timp de 15 minute. Suspensia este răcită într-un vas cu gheață. Se filtrează într-un balon. Suspensia celulară este centrifugată timp de 10-15 minute. Eliminați tripsina. Din sedimentul celular se prepară o masă combinată, se toarnă în eprubete de 1 ml, iar celulele sunt cultivate.
47. Soluții de bază și medii nutritive.Origine Distingeți mediile de gropi naturale și mediile de gropi artificiale. Naturi - din punct de vedere biologic activ: lichid embrionar, alantoic plus adaos de soluții echilibrate de sare. Artificial - preparat din componente individuale. Cel mai adesea, se folosesc medii universale pentru gropi și pot exista unele speciale. Universal este mediu 199 și Needle mediu. Compoziția mediilor de artă ar trebui să includă aminoacizi, vitamine, enzime și soluții echilibrate de sare, uneori un indicator (roșu fenol). Esența indicatorului este detectarea unui virus prin schimbarea culorii. În timpul vieții celulei, pH-ul se schimbă în partea acidă. Într-un mediu acid, culoarea indicatorului se schimbă de la roșu purpuriu la galben. Uneori, în mediul nutritiv se adaugă ser de sânge normal și un volum de 100% din volumul mediului. Serul se numește factor de creștere. Se adaugă pentru propagarea celulară, numai în medii de creștere . Scopul utilizării: mediu de groapă de creștere - există ser; de susținere - fără ser. Soluții echilibrate de sare: toate sunt derivați ai serului salin. Sunt folosite ca bază pentru prepararea mediilor de groapă și pentru toate manipulările cu culturi celulare (pentru a spăla ceva). Acestea sunt soluțiile lui Hank și Earl. Soluții de dispersie: pentru separarea celulelor de altele și a celulelor din sticlă. Soluții de pepsină, tripsină. Din sticlă - soluții de versine. Soluția Versin leagă cationii de calciu.
50. Titrul virusului. Titrul virusului este cantitatea de virus, adică doza pe unitatea de volum a materialului care conține virus. 3 metode de titrare: 1 metoda: titrarea virusului în funcție de efectul infecțios al virusului cu efect evaluat statistic. Prin metoda stuf și mench sau prin kerber. Titrul este exprimat în doze de 50%. Acesta este ED50. Pentru această metodă de titrare se poate folosi orice model biologic, dar acest model trebuie să fie sensibil la virusul care este titrat (culte celulare; embrioni; animale de laborator). În funcție de efectul infecțios al modelelor biologice infectate, acestea se împart în după următoarele criterii: în funcție de recunoașterea clinică; în funcție de modificările patomorfologice; la moartea modelului; acumulare de hemaglutinină. Rezultatele muncii depind de doza de virus. S-a stabilit că doza de virus care provoacă 50% din efectul infecțios este cea mai puțin supusă fluctuațiilor și este cea mai determinată dintre toate dozele posibile. Titrul este exprimat ca o doză eficientă de 50%. Acesta este ED 50. În funcție de modelul biologic utilizat și de efectul obținut, doza de 50% poate fi exprimată în următoarele unități: LD 50 - aceasta este o doză letală de 50% primită într-un laborator în viață prin efect letal. ID 50- aceasta este 50 la suta din doza infectioasa determinata pe baza semnelor clinice sau modificarilor patomorfologice. ELD 50- Aceasta este 50% din doza letală embrionară determinată pe embrionii de pui la sfârșitul anului. EID 50- aceasta este 50 la suta din doza infectioasa embrionara determinata pe embrioni de gaina prin modificari patomorfologice si prin acumularea de hemaglutinina. CPD 50 este o doză citopatogenă de 50% determinată pe culturi celulare prin cpd. Dacă în sistemele infectate nu observăm 50 la sută din efectul acelor ID 50, atunci calculăm titrul după trestie și mench: lg LD 50 = lg EVA - (% ani de EVA - 50%) / (% ani de EVA - % ani de ACI) TOATE ACESTEA ESTE MULTIPLICATE DE lg multiplicitatea de reproducere. 2 metoda : asupra efectului infectios al virusului cu evaluarea unui singur efect. Cu metoda de formare a plăcii în cultura celulară - un singur efect. Se exprimă în unități formatoare de variolă sau în unități formatoare de plăci PFU. Se prepară o diluție de 10 ori a virusului; selectați modelul biologic sensibil; cel puțin 4 embrioni sunt infectați în fiecare diluție a virusului. Titlul se calculează după formula T=a împărțit la V*n. a - numărul mediu de urme sau plăci. V este volumul conținutului de material = 0,2. n este gradul de diluare a virusului. 3 metoda: în funcție de efectul hemaglutinant al virusului în GAEN. Au pus RGA.
38. Principiile diagnosticului de laborator al infecţiilor virale.
Studiile de laborator joacă un rol important în stabilirea diagnosticului bolilor infecțioase, prescrierea terapiei etiotrope și monitorizarea eficacității tratamentului. Procesul de diagnosticare specifică de laborator se bazează pe identificarea agentului patogen și răspunsul organismului uman în timpul procesului infecțios. Se compune din trei etape: colectarea materialului, transportul acestuia (pinten nr. 39) și studierea lui în laborator: 1) Metoda virologică cuprinde două etape principale: izolarea virusurilor și identificarea acestora. Culturi celulare, embrioni de pui și uneori animale de laborator sunt folosite pentru a izola virusurile. Prezența virusului în culturile infectate este determinată de dezvoltarea degenerării celulare specifice, adică. efect citopatogen, detectarea incluziunilor intracelulare, precum și pe baza detectării unui antigen specific prin imunofluorescență, reacții pozitive de hemadsorbție și hemaglutinare. Virușii sunt identificați prin metode imunologice: inhibarea hemaglutinării, fixarea complementului, neutralizarea, precipitarea gelului, imunofluorescența. 2) Reacții serologice; 3) Metoda imunologică (biotestele); 4) ELISA și PCR. După primirea rezultatelor examinării și luând în considerare datele epizootologice și clinice, se stabilește un diagnostic final.
39. Luarea, pregătirea și trimiterea impasului. Material pentru un virolog. Cercetare.
Imposul de preluare, transport și cercetare. materialul este reglementat de legislația veterinară. Luând în considerare tropismul virusului - localizarea preferată a virusului în această boală și patogeneza. E timpul de la impas. material până la sfârșitul studiului său - 2-4 ore. Dacă este nevoie de mai mult timp, conservați (metode chimice - soluție 50% de glicerol, fizic - congelare), dar nu pentru luminoase. microscopie. Transport in special containere cu însoțitor document si curier. Preparatul consta in extragerea virusului din celule. lichid material - filtrare și centrifugare. Pentru a curăța bacteriile - bacteriene. filtre și antibiotice (500-2000 UI la 1 ml), din fungi - fungicide (25 UI la 1 ml), se mențin 30-40 de minute, se face culturi pentru nutriție. mediu (aerobi - MPA, MPB, NRM, anaerobi - Kitta-Tarozzi, ciuperci - Czapeka, Saburo). Pat.material dens: 1) se iau 1-1,5 g de pat.material; 2) se pisează cu foarfecele; 3) se spală cu steril. sticlă sau nisip într-un mortar; 4) suspensie 10% cu soluție Hank; 5) de 2 ori congelați și dezghețați; 6) filtrare printr-un filtru de tifon; 7) centrifugare (3000 rpm, 15 min); 8) supernatant - un material care conține virus, se verifică pentru bacterii (medii nutritive), se adaugă antibiotice și fungicide.
40.Metoda microscopică de cercetare în virologie.
1. Microscopie cu lumină: 1) pentru depistarea virusului variolei (metoda argintului conform Morozov); 2) Pentru a detecta corpuri de incluziune (aceasta este o acumulare de virioni sau din părți sau produse ale reacției unei celule la un virus; aceștia pot fi intranucleari și citoplasmatici); 3) detectarea virusului CPE (rotunjire, fragmentare, moarte); 4) detectarea simplastelor; 5) lucrul cu C/C; 6) evaluarea serologului. reacții (ELISA, RGAd, RTGAd). 2. Microscopia luminescentă: esența este că atunci când sunt iradiați cu raze UV, atomii sunt excitați, apoi trec în starea inițială cu eliberarea de energie sub formă de radiație luminoasă, intensitatea acesteia este estimată în cruci (verde smarald = ++ ++; verde = ++ +, verde-galben = ++, galben = +, fără strălucire = –). Complex – MAE.Esența MAE – specific. interacțiunea anticorpului cu serul marcat cu fluorocrom (conjugat). 3. Microscopia electronică: 1) detectarea oricărui virus; 2) studiul mărimii, formei, structurii, tipului de simetrie, reproducerii acestuia; 3) studiul interacțiunii virusului cu celula.
Avem propria noastră colecție națională specializată de bacterii și viruși. Oamenii de știință au colectat cu minuțiozitate mostre din întreaga lume de zeci de ani. Pentru ce?
Trecând pe lângă instituția de stat „Centrul Republican Științific și Practic de Epidemiologie și Microbiologie” a Ministerului Sănătății, situată pe strada Filimonov din Minsk, mulți nici măcar nu bănuiesc că vesela clădire albastru-albastru este de fapt o cetate aproape inexpugnabilă. Aici este stocată colecția națională de viruși și bacterii, dintre care multe pot ucide cu ușurință o persoană și pot provoca o epidemie la scară globală.
Sunt la intrarea în clădire. Camerele de fațadă mă privesc fix. Mâinile în buzunare, mă plimb pe hol, întrebându-mă dacă groaznicele exponate ale colecției sunt atât de strict păzite. Desigur, nu intenționez să fac sabotaj, dar este curios.
Pentru a ajunge pe teritoriul Colecției, trebuie să deschideți ușa folosind un card electronic. Și nu poți intra decât într-un mic vestibul. O ușă cu un semn de alarmă „Zonă de pericol” și o pictogramă galbenă otrăvitoare de pericol biologic este următorul nivel de protecție.
Mai jos pe coridorul larg se află camera de observație. Personalul este permanent de datorie aici. Imaginile de la camerele interne sunt afișate pe monitor. Cat de mult? Zece? Douăzeci? În primul rând, această măsură va permite identificarea unui oaspete neinvitat, dacă acesta apare în pereții clădirii. Deși acest lucru este complet exclus.
În al doilea rând, va ajuta să răspundeți cât mai repede posibil dacă un angajat dintr-una din sălile de laborator are nevoie de ajutor.
Prin sticlă groasă cu două straturi mă uit în camera alăturată. Cele mai puternice microscoape cu ieșire de imagini pe monitoarele computerului. Rânduri de eprubete și baloane, bixes cu unelte. Ușa este integral metalică. Nu rupe, nu sparge. Dar pe cardul electronic al lui Larisa Mikhailovna, bariera răspunde cu un clic liniștit. Ghidul explică că este una dintre puținele cărora li se permite accesul în toate incintele centrului. Majoritatea angajaților au acces doar la un număr limitat dintre aceștia.
Lucrările cu material infecțios - viruși și bacterii periculoase - se desfășoară în sălile de laborator ale așa-numitei zone infecțioase, care este separată de „zona curată” printr-o cameră de inspecție sanitară. Printr-o fereastră de pe coridor, privesc în miezul centrului, unde are loc contactul între asistentul de laborator și virus.
Cu toate acestea, nu observ astfel de siluete familiare în costumele spațiale din filmele cu dezastre. Oamenii sunt îmbrăcați în salopete, cu mănuși medicale obișnuite și cu aparate respiratorii ușoare. De moartea cumplită sunt despărțiți de cutii de sticlă și metal. Acolo, în aceste cutii, prin mănuși groase încorporate și manipulatoare, ei experimentează pe viruși periculoși.
Până acum, nu s-au întâmplat incidente. Cu toate acestea, în niciun caz nu poate fi exclusă posibilitatea. Prin urmare, fiecare angajat urmează o pregătire specială în conformitate cu regulile de lucru cu material infecțios și certificare pentru a obține un permis de muncă, care este aprobat de directorul centrului. Printre întrebările de testare, se numără și următoarele: „Ce ar trebui să fac dacă o fiolă cu un virus se sparge în cameră?” Singurul răspuns corect este: „Nu se poate”.
Sunt în pierdere. Crescut, în general, în filmele de la Hollywood despre tot felul de apocalipse zombie și epidemii globale, știu clar că toate necazurile la scară mondială încep cu faptul că un asistent de laborator neglijent se împiedică și scăpa un vas fragil cu conținut. Neapărat pe o suprafață metalică sau exact pe colțul mesei. Un „bing” sonor, un nor ușor de ceață, stropi de lichid, o cameră de prim-plan arată un grătar de ventilație. Sirene, lumini intermitente, strigăte după ajutor... Chestii de genul ăsta.
În realitate, la noi, nimeni nu lucrează cu virusuri din prima și a doua grupă de patogenitate (cel mai agresiv dintre cele patru existente) în așa fel încât să existe posibilitatea de a sparge sau sparge ceva.
Cum este livrat containerul cu virus captiv în centru? Larisa Rustamova demonstrează un mic recipient metalic. Deschide capacul etanș. În interior - recipiente cu agent frigorific, între care este prinsă o carcasă de plastic. Și numai în ea este o fiolă fixată rigid. La fel ca într-un basm: într-un iepure - o rață, într-o rață - un ou, într-un ou - un ac, iar la sfârșitul lui - moarte ... Adevărat, în cazul meu, toată această „varză” conține o eprubetă goală. Dar „hainele” cu o umplutură mortală sunt „înlăturate” numai în cutii, înaintea sistemelor de protecție ale cărora cedează chiar și cea mai vicioasă și atotperfuzătoarea boală.
În toate spațiile interioare, în spatele ușilor ermetice, se menține un mod special de ventilație, în cutii - presiune negativă. Să presupunem cea mai proastă opțiune: o fiolă cu conținut teribil în linia defensivă este sfărâmată în bucăți. În acest caz, aerul, pe parcurs, preluând virusul, va fi tras în canalele de ventilație cu un fluier. Și există un sistem complex de filtre fine care captează particulele de virus.
Desigur, ventilația nu poate eșua?
În cazul unei întreruperi de curent, chiar și la scară largă a orașului, avem un generator de curent autonom care se conectează automat.
În vremea noastră, globalizarea are loc. Granițele dintre țări sunt încețoșate, turiștii călătoresc în jurul lumii, aducând cu ei o varietate de boli. Din acest motiv, în camerele de congelare ale centrului, alături de viruși și bacterii izolate pe teritoriul țării (gripa, encefalită transmisă de căpușe, hepatită), sunt depozitați agenți patogeni în special periculoși ai febrei hemoragice. Există Ebola, care provoacă moartea în 90 la sută din cazuri, și nu mai puțin insidiosul virus Lassa, agentul cauzator al febrei hemoragice severe. Colecția include, de asemenea, virusul Marburg, care a fost izolat pentru prima dată în Germania și a luat odată viețile unui număr mare de oameni. Toată lumea știe astăzi despre virusul Zika. Oamenii de știință ai centrului l-au captivat și au început să studieze în zilele URSS.
Nimeni nu poate garanta că, la un moment bun, ciuma, variola, care odinioară a ucis milioane de oameni și acum a dispărut, nu va reapărea. Din acest motiv, în centrul epidemiologiei și microbiologiei, oamenii de știință stochează chiar și viruși și bacterii „dezafectate” de natura însăși.
Pe scurt despre aspectul moral. Cu câteva zile înainte de sosirea mea, laboratoarele centrului tocmai finalizaseră cercetările cu viruși periculoși asupra animalelor de laborator. Șoarecii și cobaii au devenit în mod tradițional subiecți experimentali.
Cum poți să privești cu calm în ochii animalelor mici, a căror parte leul le condamni în mod deliberat la moarte? - Îl provoc pe interlocutor.
Desigur, este sincer păcat că trebuie efectuate astfel de experimente. Dar scuze vorbim despre sănătatea umană, despre existența națiunii în ansamblu. Imaginează-ți că vezi în fața ta un copil bolnav, pe care nu-l poți ajuta doar pentru că la un moment dat te-ai întrebat: „Cum pot salva mai mulți șoareci?”. Prioritățile trebuie stabilite corect.
