Этапы лабораторной диагностики вирусных болезней. Устройство вирусологической лаборатории.
1) Индикация (обнаружение) вируса в патматериале:
Экспресс-методы:
a) Обнаружение вирионов:
(1) Электронной микроскопией;
(2) Световой микроскопией (оспа);
b) Обнаружение вирусных АГ в серологических реакциях (РИФ, ИФА, РСК, РДП, РНГА);
c) Обнаружение телец-включений методами световой и люминесцентной микроскопии;
d) Обнаружение вирусных нуклеиновых кислот методами ПЦР, ДНК-зондов;
e) Обнаружение гемагглютининов в РГА;
f) Обнаружение инфекционной активности вируса в биопробе.
2) Изоляция (выделение) вируса из патматериала. Изоляцию проводят независимо от результатов первого этапа методом биологической пробы в трёх «слепых» пассажах. Пассаж – это заражение живой системы, с целью получения новой популяции вируса. «Слепой» пассаж – заражение без видимых признаков репродукции вируса. Через три пассажа в клетках живой системы происходит накопление вируса, что сопровождается появлением признаков репродукции, видимых на уровне макроорганизма. Например, при биопробе на животных : клинические признаки, гибель, патизменения; на куриных эмбрионах – гибель, патизменения, гемагглютинация; на культуре клеток – ЦПД, гемадсорбция, бляшки, РИФ и др. Такие зараженные живые системы определяют как положительная биопроба. Однако точно установить вид инфекционного агента еще нельзя. Поэтому от положительной биопробы отбирают патологический материал, который условно считают вторичным, т.е. отобранным из живой системы с признаками положительной биопробы. Из него готовят вируссодержащую суспензию или мазки-отпечатки (выделенный вирус).
3) Идентификация (определение вида) выделенного вируса в серологических реакциях или методом ПЦР-анализа. В редких случаях возможна идентификация по другим признакам, например по внутриклеточным включениям (тельца Бабеша-Негри для бешенства).
4) При необходимости – доказательство этиологической роли выделенного вируса. Для этого применяют серологические реакции, в которых в качестве антигена используют выделенный вирус и в качестве антител – парные пробы сыворотки крови в двукратных последовательных разведениях. Положительным результатом, доказывающим этиологическую роль выделенного вируса, является увеличение титра антител во второй пробе сыворотки крови по сравнению с первой в 4 и более раз.
5) Ретроспективная диагностика. С этой целью используют парные сыворотки крови, взятые на этапе выздоровления, которые исследуют в серологических реакциях со стандартным специфическим антигеном в соответствии с предварительным диагнозом на вирусную болезнь. Нарастание в 4 и более раз титра антител во второй пробе по сравнению с первой свидетельствует об активном инфекционном процессе, протекающем в организме животного в период взятия у него крови. При этом болезнь вызвана тем вирусом, к которому установлено повышение титра антител в парных сыворотках.
Устройство вирусологической лаборатории.
Для организации диагностической лаборатории используют изолированный отсек, состоящий не менее чем из 5-6 комнат.
Под лабораторию отводят светлое помещение. Комнаты для работы с вирусным материалом должны быть хорошо освещены и состоять из предбоксника и бокса, разделенных стеклянной перегородкой с дверьми. В боксах размещают только столы, стулья и принадлежности для работы. Поверхность столов покрывают нержавеющей сталью, пластиком или стеклом, а над рабочей поверхностью устанавливают бактерицидные лампы. У входа в бокс кладут резиновый губчатый дезковрик, пропитанный дезраствором. В предбокснике лежат стерильная одежда и оборудование, соответствующее назначению бокса. Лабораторию обеспечивают холодной и горячей водой и вентиляцией с подачей стерильного воздуха.
Для регистрации поступающего патматериала предназначена приемная, где размещают несколько столов, обитых оцинкованной жестью, и емкости с дезрастворами (3% хлорамина, натрия гидроксида или 5% фенола).
В комнате для предварительной обработки материала (вскрывочной ) вскрывают трупы и отбирают материал для дальнейшего исследования.
Комнаты-боксы оборудуют в зависимости от назначения.
В автоклавной стерилизуют посуду, питательные среды, аппаратуру, питательные среды и обезвреживают инфекционный материал. Необходимо иметь два автоклава: для чистых материалов и для инфицированных.
Моечная предназначена для мытья посуды, аппаратуры и приборов.
Виварий должен иметь карантинное отделение, комнаты для здоровых и экспериментальных животных и подсобные помещения.
Для вирусологической лаборатории любого типа обязательной частью лаборатории является настольный бокс или лучше бокс с ламинарной подачей воздуха.
В вирусологической лаборатории проводят работу по выделению штаммов вирусов, их идентификации и культивированию, выполняются различные научные исследования. При работе с вирусами необходимо прежде всего:
1. Не допустить загрязнения штаммов вирусов посторонней микрофлорой;
2. Обеспечить безопасность работающего персонала от возможного заражения вирусами;
3. Обеспечить безопасность окружающего населения от заражения вирусными инфекциями через сточные воды, трупы экспериментальных животных и т.п.
При исследовании материалов, полученных от больных вирусными инфекциями, с целью лабораторной диагностики этих заболеваний применяются различные методы:
· Методы электронной и в меньшей степени световой микроскопии;
· Методы выделения и культивирования вирусов в культурах клеток;
· Методы выделения и культивирования вирусов в развивающихся куриных эмбрионах и в организме чувствительных экспериментальных животных;
· Выявление вирусов по их гемагглютинирующей способности;
· Различные серологические методы исследования: традиционные и экспресс-методы;
· Молекулярно-генетические методы исследования – молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция.
1.1.2. Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях
При взятии инфекционного материала от людей и животных необходимо учитывать тропизм вирусов к определённым тканям и органам, пути выделения вируса во внешнюю среду и особенности патогенеза той или иной вирусной инфекции.
Различают пневмотропные, энтеротропные, гепатотропные, лимфотропные, нейротропные и дермотропные вирусы. В зависимости от тропизма исследованию подвергают различные материалы. Например, исследуют слизь из зева, мокроту и т.п., если виру пневмотропный; испражнения – при энтеротропных вирусах; жидкость из визикул или пустул, корочки – если вирус обладает дермотропностью и т.д.
1.1.3. Обработка вируссодержащего материала
Инфекционные материалы, взятые с учётом тропизма вирусов и с соблюдением асептики, помещают в стерильную посуду, тщательно закупоривают её и направляют в лабораторию, поместив в термос со льдом.
Материал рекомендуется исследовать в кратчайший срок, так как вирусы быстро инактивируются. Сохранению вируса способствует помещение исследуемого материала (в 50%-ном растворе глицерина) в холодильник при температуре не выше 5 о С. Но самый надёжный способ – это хранение в замороженном состоянии при температуре -45 о С и ниже; в таких условиях вирус может оставаться жизнеспособным длительное время.
Обработка плотного материала, содержащего вирусы, начинается с растирания его в ступке или измельчения в специальных аппаратах – гомогенизаторах. Затем готовится 10%-ная взвесь в солевом растворе, которую центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 15-30 минут для осаждения крупных частиц. Вирусы остаются в надосадочной жидкости, которую и подвергают дальнейшему исследованию.
Жидкий вируссодержащий материал непосредственно центрифугируют и также получают надосадочную жидкость.
Если есть сомнения в бактериологической стерильности исследуемой вируссодержащей надосадочной жидкости, к ней добавляют антибиотики, чтобы уничтожить посторонние микроорганизмы. Антибиотики не влияют на вирусы, и они сохраняют свою жизнеспособность.
1.1.4.Микроскопические методы исследования в вирусологии
- Электронная микроскопия
Электронноскопические препараты готовят из очищенных и концентрированных вируссодержащих взвесей или ультратонких срезов тканей, заражённых вирусами. Вирусные объекты наносят на специальные плёнки-подложки, помещённые на опорные сеточки. Плёнки-подложки должны быть очень тонкими (не более 30 нм толщины), прозрачными и достаточно прочными, например, коллоидийно-угольные. Плёнки наносят на поддерживающие сеточки из меди (диаметром 2-3 мм) с многочисленными отверстиями. Далее препараты обрабатывают различными способами.
Методы напыления металлами применяют для получения контрастных препаратов. Пары тяжёлых металлов (золота, платины, урана и др.), образующиеся в специальном приборе в условиях вакуума и высокой температуры, направляют под острым углом на вируссодержащий препарат. Вирусы оказываются покрытыми тонким слоем металла.
Метод негативного контрастирования основан на том, что при обработке препарата некоторыми солями тяжёлых металлов, например, 1-2%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, создаётся более плотный слой, не пропускающий электроны, а котором хорошо видны более электроннопрозрачные исследуемые объекты.
Метод ультратонких срезов в сочетании с негативным контрастированием является наилучшим для изучения тонкого строения вирионов и изучения этапов взаимодействия вирусов с клеткой, но в то же время он наиболее сложен. Исследуемые кусочки инфицированной ткани или другого вируссодержащего материала фиксируют в специальном фиксаторе (например, осмиевом). Обезвоживают путём последовательного помещения в спирты возрастающей крепости. Заливают образцы специальной пластмассой, после полимеризации которой образуются твёрдые прозрачные блоки. Из блоков готовят ультратонкие срезы толщиной 10-20 нм на специальном микротоме, Полученные срезы контрастируют, помещая в раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты.
Приготовленные вышеописанными способами препараты изучают в просвечивающем электронном микроскопе, разрешающая способность которого достигает 0,2-0,3 нм. Изображение препарата наблюдают на флюаресцирующем экране электронного микроскопа и фотографируют специальные фотопластинки, с которых получают отпечатки. Получаемые увеличения: ×100000-×400000.
Сканирующая электронная микроскопия осуществляется с помощью сканирующего электронного микроскопа, в котором тонкий пучок электронов быстро перемещается по исследуемому объекту, то есть сканирует его поверхность. В результате возникает излучение вторичных электронов, которое, проходя через катодно-лучевую трубку, преобразуется в объёмное изображение объекта на флюоресцирующем экране.
Сканирующая микроскопия позволяет получать трёхмерное изображение вирионов (предварительно препарат напыляют металлами), различать детали строения их поверхности, но не выявляет их внутреннюю структуру. Разрешающая способность сканирующего микроскопа равна 7-20 нм.
- Световая микроскопия
В световом микроскопе можно увидеть крупные вирусы, размеры которых находятся в пределах разрешающей способностимикроскопа - не менее 0,2 мкм. А также внутриклеточные включения в поражённых вирусом тканях.
Крупные вирусы, например, поксвирусы, и включения обнаруживают с помощью специальных методов окраски, в фазовом контрасте, в тёмном поле зрения; применяют и люминесцентную микроскопию.
Крупные вирусы выявляют путём окраски по Морозову (серебрением). Для выявления внутриклеточных включений приготавливают гистологические срезы из поражённых тканей, препараты-мазки или отпечатки. Обычно препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе, иногда другими методами. Наибольшее практическое значение имеет обнаружение включений Бабеша-Негри в нервных клетках головного мозга при бешенстве. Для этого препараты окрашивают по Манну.
Люминесцентная микроскопия. Препараты, приготовленные из материалов, содержащих крупные вирусы, внутриклеточные включения, скопления вирусных антигенов, окрашивают растворами флюорохромных красителей. При люминесцентной микроскопии в УФ-свете окрашенные акридин-оранжевым скопления РНК-геномных вирусов и образуемые ими включения видны как светящиеся красные гранулы на фоне бледно-зелёной цитоплазмы клеток; ДНК-геномные вирусы дают изумрудно-зелёное свечение.
Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении вирусов, внутриклеточных включений, скоплений вирусных антигенов со специфическими противовирусными антителами, меченными флюорохромными красителями. Образовавшиеся комплексы дают свечение при люминесцентной микроскопии.
46. Культуры клеток и их виды. Система в которой клетки, ткани или органы изьяты из организма сохраняют свою жизнеспособность не менее 24 часов. Переживающие: в которых клетки только сохраняют присущую им жизнидеятельность без размножения. Растущие: сохраняют присущую им жизнидеятельность и с способны к пролифирации. По характеру росто растущие делятся на 3 группы: суспензионные; плазменные (культуры фиксированных кусочков ткани); однослойные. Однослойные делятся на 4 группы: первичнотрипсинизированные; субкультуры; полуперевиваемы и перевиваемые. Суспензионные: растут в виде суспензий, клетки размножаются со специальной средой плюс постоянное перемешивание используют роллеры. Клетки растут по всей поверхности матраца. Большое количество клеток для вакцин. Плазменные: кусочки ткани фиксированные плазмой, это тканевая культура. Ее получают путем фиксации кусочка ткани на стекле вирусологической посуды, затем добавляют пит среду и культивируют; при этом рост клеток регестрируют по переферии кусочка ткани. Используют с целью получения кусочков ткани. Однослойные : для индикации вируса. Из тканей или из органов получена путем обработки их трипсином. Субкультуры получают из первичных путем перевивания. Далее полуперевиваемые путем многокрвтных перевиваний. Они имеют диплоидный набор хромосом. Может выдержать диплоидные в зависимости от возраста или ткани из которой получали клеточную культуру. Если эмбрион – до 80 дней. Взрослого – не больше 25 перевиваний. Старого не больше 5. Перевиваемые – это мутировавшые клетки те раковые. Они выдерживают бесконечное количество раз. Это трансформированные клетки – раковой опухоли. Hela – самая известная перевиваемая клеточная культура с 1956 года. Эта культура есть во всех лабалоториях мира. Она адаптирована ко многим возбудителем. Первиваемые имеют ряд преимуществ: не погибают; выше интенсивность роста; они все генетически однородны. В лаболпториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в др.
59. ЦПД. Это Метод индикации вируса в клеточной культуре. Цпд называют любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Использую малое величении при рассмотре верхнего слоя матраца. Сравнивают зараженные клетки с незар. Отличия могут захватывать вест монослой или только участками. Оценивают в кристах или баллах. Так если изменению подвергся весь мономлой цпд оценивают на 4 креста; если ¾ - на 3 кр; ½ на 2 кр; ¼ - на 1 крест. Формы цпд зависят от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и тд. Одни вирусы проявляют цпд через 2 – 3 суток, другие через 1-2. 3 формы цпд: франментация – разрушение клеток на отдельные фрагменты, которые отделяются от стекла и переходят в культуральную житкость. Округление – потеря клетками способности прикреплятся к стеклу, они принимают шаровидную форму, отделяются и свободо плавают где и погибают. Симпластообразование – растворение клеточных оболочек, в следствии чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором распологаются ядра клеток. Такие образования наз симпластами – гигантские многояд кл. Необходимо провести не менее 3 слепых пассажей для того чтобы судить о наличии вируса в исследуемом материале. Гемадсопбция – соединение эритроцитов с поверхн пораженных вирусом клеток.
51. Расчет титра вируса по Риду и Менчу. Титрование вируса со статестическим оцениваемым эффектом с расчетом титра по риду и менчу. Для этого метода титрования можно испльзовать любую биологическую модель но эта модель должна быть чувствительна к титруемому вирусу(клеточные культ; эмбрионы; лаб животные). По инфекционному действию зараженных биологических моделей делят на по следующим признакам: по клинически призн; по патоморфологическим изменен; по гибели модели; по накоплению гемагглютинина. От дозы вируса зависят результаты работы. Установлено что доза вируса вызывающая 50 проц инфекционный эффект наименее подвержена колебаниям и является наиболее определяемой из всех возможных доз. Титр выражается в эффективных 50 проц дозах. Это ЭД 50. В зависимости от испльзуемой биологической модели и от полученного эффекта 50 проц доза может выражаться в следующих еденицах: ЛД 50 – ИД 50 ЭЛД 50 ЭИД 50 ЦПД 50 – это 50 проц цитопатогенная доза определяемая на клеточных культурах по цпд. Если в зараженных системах мы не наблюдаем 50 проц эффекта те ИД 50 то титр расчтываем по риду и менчу: lg ЛД 50 = lg ВКД – (% лет ВКД – 50 %) / (% лет ВКД - % лет НКД) ВСЕ ЭТО УМНОЖЕННОЕ НА lg кратности раз
36. Правила и режим работы в вирусологической лаболатории. Все студенты проходят инструктаж и обучение безопасным методам тр. Вход в производст помещение посторонних лиц а так же вход без халата и сменной обуви запрещен. Запрещено выходить за пределы лаб в халате и шапочке. Курить, принимать пищу в лаб и хранить продукты питания. Весь материал поступающий в лаб должен рассматриваться как инфицированный. По окончанию работы рабочее место приводят в порядок и тщательно деценфицируют. Маркировка посуды содержащий инфекционный материал. Руки в перчатках промывают в банке с 5 проц роствором хлорамида, затем перчатки снимают и обеззараживают втрично, дезенфицируют и моют. работа вирусолог лаболатории строится на трех основных принципах: не допустить заражеие сотрудников или людей работающих с вир содерж материалом. Не допустить контаминацию материала (инструменты,посуда стерильны) уборка помещений с дез раствором + ультофиолетов лампы. Не допустить выноса вируса за пределы лаб (с воздухом, посудой, твердым и житким материалом). Пипетки, стекла необходимо сбрасывать в стерилизатор. Пробирки с вирусами, ткани – в автоклав. Запрещается открывать центрифугу пока она не остановится. Удалять воздух из шприца нужно только в ватный тампон с 75 проц спиртом. Запрещается проветривать помещение система вентиляции с фильтром.
37. Техника безопасности с вируссодержащим материалом. Не допускать рассеивание вирусов во внешней среде. Предотвратить контаминацию (загрязнение) вируссодержащего материала посторонней микрофлорой. Обеспечить личную безопасность. Для соблюдения этих требований необходимо следущие правила работы: быть внимательным собранныи и аккуратным; быть только в халате и переодеваться в гардробе; работать только с застегнутыми манжетами в шапочке и марлевой маске; в лаболатории строго соблюдать чистоту и порядок; на рабочем столе не должно быть никаких посторонних предметов; запрещается курить и принимать пищу. Пользоваться стериными инструментами и посудой. Работать с сосудами у пламени горелки. Не брать пальцы в рот. Отработанные приборы в стерилизатор. Отработанные пипетки собирать в сосуд с дез раствором. Твердые или житкие отходы(вата) собирать в спец контейнеры для последующего обеззараживания. Запрещается выливать отходы в раковину или унитазы.
33. Механизм противовирусного действия интерферона. Непосредственного действия на вирус интерферон не оказывает. Влияет только на клетку активизируя синтез некоторых клеточных ферментов. В частности фермента протеинкиназы и 2,5 олигоасинтетазы. Информация о синтезе данных ферментов находится тоже в определенных участках генов клетки и тоже в репрессивном состоянии. Под возд интерф происходит дерепрессии генов отвечающих за синтез протеинкиназы и 2,5 илигоАсинтетазы. И их синтез резко увеличивается. 1) под возд протеинкиназы происходит фосфарирование инициирующего фактора который обеспечивает связывание с рибосомой вирусной информационной РНК. Таким образом вирусная информационная РНК не может связаться с рибосомальным аппаратом клетки т.е начало трансляции. И в конечном итог синтез вирусных белков и ферментов становится невозможным. 2) под воздействием интерферона активируется синтез 2,5 олигоАсинтетазы которая катализирует синтез в клетке 2,5 олигоАдениловой кислоты. Эта кислота переключает действие клеточных нуклеаз на разрушение вирусных информационных РНК. Таким образом под воздействием интерферона происходит: блокирование трансляции вирусных информационных РНК; разрушение вирусных информационных РНК. Ингибирующее действие интерферона на размножение клеток: интерферон в концентрации от й0 до 1000 едениц в мл подавляет размножение самых разнообразных клеток в любых тканях. Интерферон регулирует рост клеток многих типов включая первичные клеточные культуры, опухолевые клетки. В основе лежит подавление синтеза некоторых клеточных белков и синтеза новых белков интерфероном. Интер увеличивает киллерную активность Т-лимфоцитов. В больших дозах угнетают антитело образование. Небольшие дозы наоборот стимулируют антитело образование. Крайлинг – клетки обработанные небольшими дозами интерф образуют больше интр чем необработ. Слишко большие дозы – обратный процесс.
35. Типы взаимодействия вируса с клеткой. Продуктивный и абортивный. Продуктивный делится на литический и латентный. Продуктивный: это такой тип взаим при котором в клетке образуется новое поколение вириона. Если после образ нов пок вириона клетка быстро погибает то это продуктивный литический путь взаимод вируса с кл. если клетка в котор разм вирус длительное вр сохраняет свою жизнеспособность (путем почкования) то это продукт латентный тип взаимод. Абортивный: это тип взаим при кот репродукция вирионов прекращается на какой либо стадии, вир инф не развивается. В результате взаимод вир с клет в клетке могут происходить следущие изменения: дегенерация клеток – клетки сначало преобразуют неправильную форму затем округляются, в цитопл появляется зернистость затем фрагментация ядра затем гибель клетки. Такие изменения носят название ЦПД. В крестах: 4 креста – 100% цпд. Образование симпластов – многоядерных клеток. Образование телец включений – мб внутрияднрные и плазматические, рнк или ДНК содержащими. Трансформация клеток – онкогенные вирусы(ретровирусы рнк). Размножение в клетке онкогенных вир не сопровождается цпд. Клетка образует вирус постянно. Синтез интерферона.
4. Устойчивость вирусов к физико-химическим факторам . Устойчивость вирусов животных сравнительно хорошо изучена при воздействии внешних факторов: темп, излучений, ультрофиол, ультрозвук, рН, формалин, фенола и др. для защиты от этих воздействий у вирионов имеется белковая оболочка. Различное строение и хим состав белковых оболочек обуславливает неодиноковую устойчивость вирусов. В зависимости от этих особенностей один и тот же фактор может разрушать одни вирионы полностью а другие нет. Например органические растворители: те вирионы в оболочках которых нет липидов устойчивы к этим веществам а липодосодержащие быстро разрушаются. Инактивация вирусов означает полную или частичную утрату их биологической активности которая наступает в рез действ физико-химич факторов. При изменении вирусной нукл кисл и белка наступает полная инактивация т.е потеря всех биологических свойств вируса – он теряет только инфекционные свойства и сохраняет иммуногенность. Характер и степень агентов химико физической природы действующий на вирус зависит от природы инактивирующего фактора, от дозы, продолжительно, от вида вируса. При инактивации вируса может происходить или расщепление белков оболочки с последующим распадом ее на отдельные еденицы или уплотнение белков с сохранением общей структуры оболочки. Расщепление наблюдается при действии кислой и щелочной среды при продолжительном и слабом нагревании.коагуляция и уплотнение происходит при воздействии на них формальдегида, высок темп или фенола. Зависит от концентрации и продолжительности. Таким образом в одних случ коагуляция белков обол соровождается разрушением нукл кисл и у вирусанаступает необратимая потеря инфекционности. В других сл у вирусн еукл кисл способность к репродукции сохраняется. Консервируют глицерином.
60. ПЦР. Принцип метода: выявляют спецефический для данного вируса ген – участок молекулы ДНК несущий информацию для синтеза одного белка. Этот ген затем идентифицируют в исследуемом материале с помощью ПЦР. Эта реакция позволяет образовывать дополнительные копии гена – амплифицировать участок ДНК в пробирке. В зависимости от цели исследования можно выявить вид или род мо. Суть пцр: молекулу ДНК нагревают до 90-94 град. Что ведет к разрушению водородных связей между азотистыми основаниями двойной спирали а затем охлаждают до 52 гр в присутствии фермента ДНК полимиразы. Последующее повышение темп приводит к синтезу новой молекулы ДНК – комплиментарной матричной. Эту процедуру повторяют многократно в результате чего фрагменты увеличиваются. Индикацию проводят с помощью электрофореза или меченого ДНК зонда. Основные компоненты: ДНК полимираза термостабильная; олигонуклеотид из 20 нуклеотидов; трифосфаты; амплификатор, посуда и реактивы для элнектрофореза в агарозном геле. Постановка: получение ДНК образца. Для этого исследуемый материал суспендируют в буфере или дистил воде. Добавл натрий ОН и видерживают 7 мин. Смесь нейтролизуют. Лизат центифугируют в течении 10 мин для осаждения крупных частиц.надосадочную житкость используют для постановки пцр. Пцр – амплификация заданного гена фрагмента ДНК. Далее плавят в амплификаторе 3 часа. Индикация амплификата – пробу подвергают электрофорезу в агарозном геле для разделения ДНК. Через 30 мин агароза полимизируется в аппарате при этом в агарозе образуются лунки. отбирают 10 мкл смеси и смешивают с 5 мкл красителя. Смесь вносят в лунки и проводят электрофорез 40 мин. Плпстинку вынимают и 10 мин окрашивают в растворе бромида. Затем агарозу помещают на трасиллюминатор и фотографируют полученные картины полос. Полосы выявленные при ультров излуч – это фрагменты ДНК.
49. Метод заражения клеточных культур. Индикация вирусов в культурах клеток. Заражение: для этого отбирают пробирки со сплошным клеточным монослоем. Ростовую пит среду сливают, клетки пару раз промывают раствором хенкса. В каждую пробирку вносят по 0,2 – 0,1 млвирус материала и покачиванием распределяют равномерно по всему слою клеток. В таком виде пробирки оставляют от 1 до 2 часов при 22 или 37 град для адсорбции вируса на поверхности клеток. Затем вируссод материал удаляют из пробирок и наливают поддерживающую среду в пробирку 1-2 мл. монослой клеток после выделения вируса отмывают 2 раза раств хенкса и затем наливают подднрживающ среду. Индикация: по ЦПД; РГАд; по образованию бляшек; внутриклеточных включений; РИФ; электронной микроскопией
54. РТГА. РГА . Ртга: суть – при смешивании вируса со спец сывор вирус утрачивает свои гемаглютинирующие свойства. Цели – идентификация выделенного вир; обнаружение антител в исследуемой сыворотке и их титра. Компоненты – для прямого сероварианта: вируссодержащий материал, спецефическая сыворотка, 1% взвесь эритроцитов, физ раствор для разведения. Для ретроспективного – исследуемая сыворотка, стандартный антиген в определенной дозе 4 ГАЕ(титр вируса разведение) 4 гае – 1:32. Схема – к каждому разведению сыворотки добавляют равный оббьем стандартного антигена (вируса) в дозе 4ГАЕ. Контакт 30 минут при комнатной темп. В каждую лунку с разведениями сыворотки и постоянной дозой вируса в 4 гае добавляем равный оббьем взвеси эритроцитов. Контакт 30-60 мин при комн темп. Учет реакции прводят в кристах. если плюс то агглютинации нет, если минут то гемаглютинация. Титр антител в исследуемой сыворотки это максимальное разведение сыворотки котрое польностью задерживает агглютинацию эритроцитов. РГА: суть: в адсорбции вируса на поверхности эритроцита что приводит к склеиванию. Цели: индикация; для титрования вируса в гаен. Компоненты: вирус; 0.5 взвесь эритроцитов; физ раствор для приготовления. Схема пост: готовят двухкратное разведение вируса; к каждому разв вируса доб равный оббьем 0.5 % взвеси эритроц; контакт 30-60 минут при комнт тепм. Учет: в кристах. 4 криста – 100% агглютинация. 3 криста - 75% . 1 крест – агглютинация. 1 гаен это максимальное разведение вируса способное вызвать агглютинацию 50% эритроцитов.
57. ИФА. Суть: при связывании антигена+сыворотка меченая, фермент разлагает субстрат. Образуется комплекс антиген+коньюгат с образованием цветного продукта реакции оцениваемого под световым микроскопом или визуально. Цель: идентификация. Компоненты: вирус сод материал, коньюгат, субстрат. Схема постановки: кулиткру клеток фиксируют охлажденным ацетоном. Высушивают и наносят на них коньюгат. 1-2 часа инкубируют при темп 37 гр во влажной камере. Промывают физ раствопом, споласкивают дистил водой и высушивают. Наносят на него неск капель раствора субстрата, 5-10 мин инкубируют затем промывают в физ раст и споласкивают дтст водой. Учет: в положит случ т.е при наличии антигена после нанесения коньюгата образуется комплекс антиген плюс антитело меченый ферментом. После нанесения субстрата разлагается по действием фермента образуя цветной продукт хорошо видный в световом микроскопе.
56. РСК. Суть: в связывании комплимента с комплексом антиген плюс антитело. Об отсутствии свободного комплимента в этой системе судят по задержке гемолизина в индикаторной системе. Цели: идентификация; обнаружение антител и их титра в исследуемой сыворотки крови. Компоненты: 2 системы – 1)(вируссодержащий материал; спецефическая сыворотка;) (исследуемая сыворотка; страндартный антиген). 2) гемолитическая система(индикаторная) – 2-3% взвесь эритроцитов барана это антиген; гемолизин(гемолитическая сыворотка)-это антитела. Антитела соответсвуют антигену. И комплимент только на 1 реакцию: если на первую то будет задержка гемолиза когда комплимент свяжется с исследуемой системой. Если на вторую то эритроциты лизируются будет полный гемолиз. Схема постановки: реакцию ставят сначало в исследуемой системе затем в эту же пробирку добавляют индикаторную систему. Учет: положительная РСК – задержка гемолиза. Отрицательная – полный гемолиз.
7. Вирусные белки . Состоят из аминокислот. Состав вирусного белка зависит от порядка чередования аминокислот этот порядок определяется генетической информацией закадированной в вирусном геноме. Вирусные белки делят на структурные и неструктурные. Структурные белки входят в состав зрелых вирионов. Неструктурные б не входят в состав зрелых вирионов но являются обязательными на определенных стадиях репродукции. Структурные Неструктурные
8. Вирусные ферменты . Имеют белковую природу. Они могут быть связаны непосредственно с вирионом а мб не связаны – не структурные. у ДНК У РНК: РНК зависимая ДНК полимираза – в клетке его нет, нужен для “-” содержащих РНК и ДНК, содержащих у вир семейства ретровириды фермент трансгибирующий вирусный геном называется РНК зависимые ДНК полимиразы. У этого фермента названия: ревертаза, обратная транскриптаза. Ферменты принимающие участие в формирование вирусных белков: протеазы, протеинкеназа.
52. РН. Суть: при взаимодествии вируса со спецефической сывороткой вирус утрачивает свои инфекционные свойства, те способность размножаться в клетках. Цели: идентификация выделенного вируса, обнаружение антител в сыворотки крови и титр антител. Компоненты: вируссодержащий материал, спецефическая сыворотка, биологическая модель. Если ретроспективный: исследуемая сыворотка крови, стандартный антиген, биологическая модель. Общая схема постановки : смешивают антиген и антитело, контакт 30-40 минут, максимум 2 часа при температуре 37-38 нрадусов; смесью антиген плюс антитело заражают биологическую модель; наблюдение и учет. Учет: положительная РН – живы, отрицательная – погибли.
53. РДП. Суть: одноименные антиген и антитело помещенные на одинаковом расстоянии друг от друга в агаровом геле диффундируют на встречу друг к другу образуя в месте встречи преципитат в виде белой полосы. Цели: идентификация выделенного вируса, обнаружение антител в исследуемой сыворотки. Компоненты: вируссодержащий материал, спецефическая сыворотка, агаровый гель. Для ретроспективной: исследуемая сыворотка крови, стандартный антиген, агаровый гель. Схема постановки: готовят агаровые покрытия на предметном стекле, готовят лунки колодцы, вносят компоненты реакции в лунки колодцы по определенной схеме,стекло с поставленной реакцией помещаюь в термостат 37-38 С. Учет реакции через 48 часов. Положительная реакция – образование белой полосы преципитации.
55. РГАд, РТГАд . РГАд: Суть: в адсорбции эритроцитов на поверхности зараженных вирусом клеток. Цели: индикация вируса. Компоненты: зараженная вируссодержащим материалом клеточная культура; взвесь эритроцитов. Схема постановки: предварительно заражают однослойную клеточную культуру исследуемым материалом. Культуры сливают в поддерживающую пит среду. Отмывают раствором Хенкса. Вносят взвесь эритроцитов. Контакт 5-15 минут при комнатной темп. Учет: проводят под световым микроскопом. Положительная – эритроциты адсорбированы на клетках; отрицательная – эритроциты свободно плавают.РТГАд: суть: в связывании спецефических антител с поверхностью инфецированных вирусом клеток что приводит к торможению адсорбции на клетках эритроцитов. Цели: идентификация выделенного вируса. Компоненты: зараженная клеточная культура; спецефическая сыворотка; взвесь эритроцитов. Схема постановки: предварительно заражают однослойную клеточную культуру однослойным исходным вируссоднржащим материалом. Сливают в поддерживающую пит среду и вносят 0.8 мл спецефической сыворотки. Контакт 20-30 минут. Добавляют взвесь эритроцитов. Контакт 5 – 15 минут. Учет: для контроля обязательно ставят РГА. Учет в опытных прбирках: положительная – эритроциты свободно плавают, отрицательно- эритроциты тоже свободно плавают. Учет в контрольной пробирки при положительной – адсорбция, отрицательно- свободно плавают.
6. Вирусные нуклеиновые кислоты. + РНК – это вирусные нукл кислоты обладающие функцией и инфармационной РНК. Информация на белок синтезирующей системы у РНК + сразу передается геномной РНК без транскрипции. -РНК содержащие вирусы это вирусы с – односпиральной РНК которая не обладает функцией информационной РНК, у таких вирусов синтез информац РНК (транскрипция) происходит на матрице минус нити геномной РНК при помощи вирусспецефического фермента тесно связанного с гномной РНК, РНК зависимой РНК полимиразы. Существуют вирусы содержащие как плюс нити РНК так и минус, к ним относятся аденовирусы, парамиксовирусы. Геномная информация у двухспиральных ДНК кодируется на обеих нятях.Нуклеиновые кислоты представлены полинуклеотидами сост из отдельных нуклеотидов. Количество их в нукл кислоте различно. Каждый нуклеотид состоит из 3х субедениц: остаток фосфорной кислоты, углевод, азотистое основание.
9. Структура вирусов. Основные формы. Типы симметрии . Структура: ДНК: чаще двухспиральные, ген информация кодируется на обеих нитях. Вирусные ДНК могут быть расположены линейно, кольцевым способом. Могут быть односпиральные. Вирусные РНК: чаще односпиральные, реже двух. Распологаются линейно, кольцевым способом, фрагментировано. Как правило состоят из 11-12 фрагментов. Односпиральные вир РНК могут быть вдух типов: плюс нити и минус нитевидные РНК (негативный геном).Типы симметрии: расположение белковых субьедениц (капосмеров) определяет тип симметрии вириона – спиральный, кубический, комбинированный. Спиральный это тип сим при котором капсомеры распологаются вокруг нукл кислоты спирально. Такой тип сим имеют крупные вирусы и некоторые вир средних размеров. Форма: палочковидные, поливидные, шаровидная, овальная форма. У вирусов имеющих палочек форму капсид состоит из капсомеров уложенных вокруг нукл кислоты спиральными витками одного диаметра тесно прилегающих др к др. у вир сферической формы капсомеры уложены спиралью но разного диаметра. Кубический тип: его имеют большинство мелких вирусов и значительная часть вирусов средних размеров. Форма у таких вирусов сферическая. Капсомеры капсида распологаются вокруг нукл кислоты как вокруг правильного изометрического тела. белковая оболочка у таких вирусов приближается к форме икосайдра- правильного 20 гранника. Комбинированный тип симметрии: состоит из спирального и кубического. Его имеют все фаги и некоторые сложноустрвирусы семейства коксвириды. У них наружная оболочка по кубическому, капсидная по спиральному. У фагов – головка по икосейндрическому типу, отросток по спиральному.
18. Основные стадии первой фазы репродукции вирусов. Это фаза инфицирвания клетки, в эту фазу вирион должен связаться с клеткой, проникнуть в клетку и раздется. Первая стадия адсорбция вирионов на поверхности клетки может происходить двумя путями: физикохимическим(неспецефический) ; рецепторный (спецефич). Физико хим путь определяется взаимодействием поверхностных электростатических сил которые возникают между положительно заряжен группами вирусных белков и отрицат заряжен карбоксинами, сульфатными, фосфатными группами клеточной стенки. Рецепторный основан на спецефическом взаимодействии рецептора вирусного белка с комплиментарными рецепторами поверхности клеточной стенки. Рецепторы вирусов и рецепторы чувствительных к данному вирусу клеток имеют взаимодополняющую конфигурацию(как ключ к замку). Если же клетка не чувствительна то реабсорбция никогда не произойдет. Вторая проникновение – у разных вирусов происходит разными путями: при помощи виропексиса; путем сплавления оболочек. Виропексис – этот путь сходен с пиноцитозом. Сначало в месте адсорбции на поверхности клетки происходит инвагинация клеточной стенки мембраны затем края мембраны смыкаются с внутри клетки в клеточной вакуоли оказывается вирион со всеми своими оболочками. Путем сплавления - в этом случае принимающие др к др участки вирусной оболочки и оболочки клетки расплавляются под действием вирус-спецефических ферментов и в клетке оказывается только вирусная нукл кислота при этом остатки вируса встраиваются в оболочку клетки. Третья стадия – депротенизация – освобождение от оболочек – зависит от путей проникновения вируса в клетку. Если путем сплавления оболочек то депротониз как отдельную стадию не выделяют те она происходит одновременно с проникновением вируса. Если проникновение путем виропексиса то освобождение вирусной нукл кисл от оболочек начинается после разрушения белков, липидов,жиров входящих в состав вирусн оболочек. Все стадии температуро зависимы.
20. Транскрипция . Это переписывание генетической информации с вирусной нук кисл на вновь синтезируемую по законам генетического кода вирусную информационную РНК. (вирус должен представить белок синтезируемой клетке, преобразоваться в РНК). Конечный продукт транскрипции – вирусная информационная РНК. У односпиральных + РНК транскрипц отсутствует, те их геномная вирусная РНК обладает информац вир РНК. У односпиральных -РНК геном не может осуществлять функцию информационной РНК и его РНК трансгибируется при помощи вирус спецефического фермента РНК зависимая РНК полимираза. РИСУНОК!
21. Трансляция . Это процесс перевода гентической информации содержащейся в вирусных информационных РНК на спецефическую последовательность аминокислот. Происходит перевод когда четырех оснований заклеченных в вирусной информационной РНК на код 20 аминокислот. Конечный продукт трансл – вирусные белки. Синтез белка – на рибосомах клетки. Состоит из 3х фаз: инициация транслиции те начало трансляции; продолжение; терминация – конец трансляции. Инициация основана на формировании комплекса компонентов необходимых для начала трансляции т.е инициаторного комплекса с так же основана на узнавании рибосомы вирусной информационной РНК и связывание ее с определенным участками которые носит название шапочка. Это метилированный гуанин. После узнавания шапочки рибосома скользит вниз по молекуле информационной РНК пока не дойдет до участка на котором начинается декодировании информации.
5. Химический состав вирусов. Вирусы состоят из нуклеиновых кислот (ДНК,РНК). Нуклеиновые кислоты представлены полинуклеотидами состояих из отдельных неуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из 3х субьедениц: остаток фосфорной кислоты, углевод, азатистое основание. Вирусные белки : Состоят из аминокислот. Состав вирусного белка зависит от порядка чередования аминокислот этот порядок определяется генетической информацией закадированной в вирусном геноме. Вирусные белки делят на структурные и неструктурные. Структурные белки входят в состав зрелых вирионов. Неструктурные б не входят в состав зрелых вирионов но являются обязательными на определенных стадиях репродукции. Структурные вирусные белки делятся в зависимости от раположения в вирионе на след группы: капсидные белки – в капсиде; суперкапсидные б – в суперкапсиде (основная масса на белок, есть еще жиры и углеводы); матриксные белки – белки мембранного слоя; белки вирусной сердцевины – предст ферментами. Неструктурные – в зависимости от функций которые они выполняют делят на: ругулятор экспрессии вирусного генома; ингибиторы клеточного биосинтеза; индукторы разружения клеток; предшественники вирусных белковые структурные вир белки; некоторые вирусные ферменты – не входят в состав зрелых вирионов. Липиды: в основном входят в часть суреркапсидной оболочки вириона у сложноустроенных вирусов. Все они не кодируются вир геном и имеют клеточное происхождение. Представлены они фосфолипидами, гликолипидами. Углеводы: входят в состав суперкапсид обол, не кодируются вирусныи геномом и имеют клеточное происхождение, представлены гликопротеидами и гликолипидами. Вирусные ферменты: Имеют белковую природу. Они могут быть связаны непосредственно с вирионом а мб не связаны – не структурные. В стадию смены информации принимают участие ферменты ранние полимиразы и ранние репликазы. Отоносятся они к ингибиторам клеточного биосинтеза. Ферменты трансгибирующие вирусный геном: у ДНК содержащих вирусов – ДНК зависимые РНК полимиразы в клетке есть, в некоторых случаях она доступна для вирусов, в некоторых нет. Может иметь как клеточное происхождение так и вирусное. У ДНК содер-щих вирусов размножающиеся в ядре имеет клеточное происхождение. В цитоплазме – вирусное происхождение – вируспецефический.
У РНК: РНК зависимая ДНК полимираза – в клетке его нет, нужен для “-” содержащих РНК и ДНК, содержащих у вир семейства ретровириды фермент трансгибирующий вирусный геном называется РНК зависимые ДНК полимиразы. У этого фермента названия: ревертаза, обратная транскриптаза. Ферменты принимающие участие в формирование вирусных белков: протеазы, протеинкеназа.
13. Бактериофаги. Вирус бактерий. Известны ДНК и РНК бактериофаги. Большинство из ДНК фагов двухспиральные. РНК фаги односпиральные. Нуклеиновая кислота фага окружена полиэдрическим капсидом (головка), к которому у многих фагов присоединяется отросток (хвост). Диаметр головок приблиз 60-95 нм а длина отростков 250нм при толщине 10-25 нм. Отросток служит структурой прикрепления к бактерии. Взаимодействие б и микробных клеток – сложный биологический процесс, исход которого зависит от свойст фагов и проявляется лизисом бактериальных клеток. бактериофагов используют для диагностики(сибиреязвен); для лечения бактериальных инф; для профилактики инф(сальмонеллез). РИСУНОК!
22. Репликация вирусных ДНК.
23. Репликация вирусных РНК . Односпиральных РНК с негативным геномом:
25. Сборка вирионов и выход их из клетки.
: петем взрыва, разрыв, разрушение клетки в котор сформировались зрелые вирионы (простоустроенные вирусы) клетка погибает. Сложнойстроенные выходят тем почкования т.е выходят через клеточную стенку, отпочковываются. При этом клетка погибает не сразу, а когда ее запасы будут истрачены
19. Вторая фаза репродукции. Эклипс стадия: стадия смены информации. В эту стадию происходит подавление функции клеточного генома за счет того что вырус нуклеиновая кислота блокирует и вирусные ферменты блокируют генетический аппарта клетки и синтезирующие системы клетки. Это приводит к тому сто клетка прекращает репродукцию собственных клеточных компонентов и перестраивается на репродукцию вырусных компонентов. Здесь принимают участие ранние репликазы и ранние полимиразы. Транскрипция: Это переписывание генетической информации с вирусной нук кисл на вновь синтезируемую по законам генетического кода вирусную информационную РНК. (вирус должен представить белок синтезируемой клетке, преобразоваться в РНК). Конечный продукт транскрипции – вирусная информационная РНК. У односпиральных + РНК транскрипц отсутствует, те их геномная вирусная РНК обладает информац вир РНК. У односпиральных -РНК геном не может осуществлять функцию информационной РНК и его РНК трансгибируется при помощи вирус спецефического фермента РНК зависимая РНК полимираза. РИСУНОК! Трансляция: Это процесс перевода гентической информации содержащейся в вирусных информационных РНК на спецефическую последовательность аминокислот. Происходит перевод когда четырех оснований заклеченных в вирусной информационной РНК на код 20 аминокислот. Конечный продукт трансл – вирусные белки. Синтез белка – на рибосомах клетки. Состоит из 3х фаз: инициация транслиции те начало трансляции; продолжение; терминация – конец трансляции. Инициация основана на формировании комплекса компонентов необходимых для начала трансляции т.е инициаторного комплекса с так же основана на узнавании рибосомы вирусной информационной РНК и связывание ее с определенным участками которые носит название шапочка. Это метилированный гуанин. После узнавания шапочки рибосома скользит вниз по молекуле информационной РНК пока не дойдет до участка на котором начинается декодировании информации. Репликация вирусных ДНК: Репликация двух спиральных ДНК: двухспир молекула ДНК сначало разьединяется на 2 отдельные нити при помощи клеточных ферментов нуклеаз, затем на одной из нитей вирусной ДНК которой является матрицей формируется вирусная информационная ДНК. Это происходит при помощи вирусспецефического или клеточного фермента ДНК зависимой РНК полимиразы. Затем вирусная инфор РНК перемещается на рибосому клетки где происходит трансляция с образованием вирусных белков и ферментов в том числе фермента ДНК полимиразы. При помощи ДНК полимиразы из нуклеотидов клетки строится вторая комплиментарная нить ДНК. Таким образом синтезируются новые молекулы двухспиральных ДНК. Репликация односпиральных ДНК: односпир ДНК имеют позитивную полярность. При помощи вирус спецефического фермента ДНК зависимая ДНК полимиразы на матрице вирусной односпиральной ДНК образуется комплиментарная минус нить ДНК. Синтезируется двухспиральная структура которая называется репликатывная форма. Затем на матрице минус нити репликативной формы образуется плюс нити односпиральной ДНК путем вытеснения плюс нити ДНК из репликативной формы. Репликация вирусных РНК: Односпиральных РНК с негативным геномом: сразу после проникновения в клетку происходит транскрипция с образованием вирусной инф РНК плюс. В этом принимают участие вирус спецефический фермент РНК зависимая РНК полимираза. Затем вир инф РНК транслируется с образованием белков и фермента РНК полимиразы. В дальнейшем при помощи РНК полимиразы на матрице плюс нити информац РНК образуется дочерние односпиральные минус нити РНК. Односпиральных РНК с позитивным геномом: после проникновения в клетку плюс РНК сразу связывается с рибосомами где транслируется с образованием белков и фермента в том числе фермента РНК репликазы. Затем под действием РНК репликазы образуется репликативная форма. На матрице минус РНК репликативной формы образ плюс нити РНК путем вытеснения их из репликативной формы. Репликация двухспиральных вирусных РНК: синтез информационных вирусных РНК происходит на матрице двухспиральной РНК при помощи фермента РНК зависимая РНК полимиразы. Транскрипция на матрице нити РНК каждый фрагмент транскрибтруется отдельно. Затем транслируются с образованием белков и фермента РНК полимиразы при помощи этого фермента на плюс нитях информационной РНК образуютя комплиментарные минс нити РНК т.е двух спиральные РНК. Сборка вирионов и выход их из клетки: 2 стратегии при сборке, созревании и выходе из зараженной клетки: осуществление сборки и созревания внутри клеток; сочетание последней сткпени сборки вириона с выходом из зараженной клетки.
Сборка осуществляется путем простого агригатирования, т.е обьединение вир белка с нукл кислотой происходит под действием физикохимических факторов, т.е осуществляется самосборка. В ее основе лежит обьединение и спецефическая без белковое и белок-нуклеиновое узнавание. Формируется нуклеокапсид. Для просто устроен вирусов на этом процесс самосборки заканчивается. У сложноустр вирусов процесс самосб осуществл иначе. Часть белка идет на формирование нуклеокапсида кот формируется как у простоустр вирусов а часть белков перемещается к клеточной мембране. Туда же в дальнейшем перемещается сформированный нуклеокапсид. И формирование суперкапсид оболочки происходит при выходе вириона из клетки т.е нуклеокапсид покрывается сверху белками которые переместились к клеточной мембране и при выходе в эту внешнюю оболочку встраиваются жиры и углеводы из клетки. Выход осущетвляется двумя путями : петем взрыва, разрыв, разрушение клетки в котор сформировались зрелые вирионы (простоустроенные вирусы) клетка погибает. Сложнойстроенные выходят тем почкования т.е выходят через клеточную стенку, отпочковываются. При этом клетка погибает не сразу, а когда ее запасы будут истрачены.
62-63. Оспа овец и коз (род Caprippoxvirus). Контагиозная эктима овец и коз (род Parapoxvirus).Семейство: poxviridae. ДНК содержащие. Особенности репродукции: геном вируса оч большой.даже в клетках зараженных репликация завершается через 6 часов. Проникновение происходит путем сплавления оболочек вирусной и клеточной. После проникновения происходит расщепление двухспиральной ДНК и репликация начинается сразу на обеих нитях ДНК. Причем синтез вирусных компонентов происходит в цитоплазме клеток. Сборка вириона в цитоплазме. Выход путем почкования.
2. Роль вирусов в инфекционной патологии животных . В настоящее время вирусные болезни имеют большое значение в инфекционной патологии животных, человека и растений. Их роль возрастает по мере снижения и ликвидации бактериальных, микозных и протозойных заболеваний. Вирусные болезни примерно составляют 80 процентов в медицине а в ветеринарии 50 проц. Известно свыше 500 болезней вызываемых вирусами. Вирусное происхождение установлено у таких особо опасных болезней как ящур, чума крс, чума свиней и т.д. вирусологию можно разделить на общую и частную. Общая изучает природу и происхождении вирусов, их классификацию, строение и химический состав, генетику и селекцию, методы диагностики и профилактики, основы противовирусного иммунитета. Частная вир изучает название и систематическое положение конкретных возбудителей, строение, размеры, и устойчивость вириона, терапию, методов диагностики, профилактику.
1. История развития . Первый период начинается с древних времен до 1892 г. В этот период вирусология как самостоятельная наука не существовала. Изучение болезней с неизвестной этиологией занимались бактериологи. Второй период – формирование вирусологии как самост науки – охватывает 1892-1950гг. этот период начался с открытия русского ботаника Д.И. Ивановского(1898) филитруемости возбудителя мозаичной болезни табака. Ивановский изучая этиологию болезни табака установил что эту болезнь вызывает особый мельчайший микроорганизм который проходит сквозь бактериальные фильтры. Он невидим под световым микроскопом. Не растет на искусственных пит средах. в дальнейшем подобные м.о были выделены у других растений а так же у животных и человека. Их обьеденили в самостоятельную группу – ультровирусы. В 30-х годах 20 в в вирусологической практике стали применять куриные эмбрионы. В 1956 г Стенли удалось резделить вирус на основные компоненты – белок и нуклеин кислоты. В конце 40х годов 20в создание электронных микр Руденберг. А световой создал Левенгук. Советские ученые внесшие вклад в вирусологию: жданов, лихачев, сюрин.
48. Методика получения однослойных первично-трипсинизированных клеточных культур. Однослойные кл к нужны для индикации вирса. Ее получают из тканей или органов путем обработки их трипсином. Однослойные делятся на 4 группы: первичнотрипсинизиров;субкультуры;диплоидные или полуперевиваемые;перевиваемые. Ткань измельчают и диспергируют ферментом – трипсином. Затем трипсин удаляют с помощью центрифугирования а к полученному осадку добавляют определенный оббьем житкой питательной среды. Клетки выращивают в виде одного слоя – монослоя на внутренней поверхности стекла. Постоянная потребность в органах от здоровых животных. И спользуют эмбрионов 9-112 дн. Овоскопия. Обработка скорлупы. Ножницами срезают скорлупу выше граници пуги. Стерильно извлекают эмбрион. Отмывают раствором хенкса. Готовят кожно мышечный мешок. Отмывают раствором хенкса. Ткань измельчают ножницами. Переносят в колбу для трипсинизации. Колбу ставят на магнитную мешалку 15 минут. Суспензию охлаждают в сосуде со льдом. Фильтруют в колбоприемник. Взвесь клеток центрифугируют 10-15 минут. Удаляют трипсин. Из осадка клеток готовят обьединенную массу, разливают в пробирки по 1 мл и культивируют клетки.
47. Основные растворы и питательные среды. По происхождению различают естественные пит среды и искусственные пит среды. Естеств – из биологически активных: эмбриональная, аллантоисная житкость плюс добавление солевых сбалансированных растворов. Искусственные – готовят из отдельных компонентов. Наиболее часто используют универсальные пит среды а могут быть специальные. Универсальная это среда 199 и среда Игла. В состав искусств сред должны входить аминокислоты,витамины,ферменты и сбалансированные солевые растворы, иногда индикатор (феноловый красный). Суть индикатора – обнаружение вируса по изменению цвета. В процессе жизнидеятельности клоток рН меняется в кислую сторону. В кислой среде цвет индикатора с малиново красного меняется на желтый. В питат среду добавляют иногда нормальную сыворотку крови и обьеме 100 проц от обьема пит среды. Сыворотка крови называется фактором роста. Ее добавляют для размножения клеток, только в растовые пит среды. По целям использования: ростовые пит среды – есть сыворотка; поддерживающие – сыворотки нет. Сбалансированные солевые растворы: все они производные физ раствора. Используют как основу для приготовления пит сред и при всех манипуляциях с клеточными культурами(отмыть что то). Это растворы Хенкса и Эрла. Диспергирующие растворы: для разделения клеток др от др и клеток от стекла. Растворы пепсина, трипсина. От стекла – растворы версина. Раствор версина связывает катионы кальция.
50. Титр вируса . Титр вируса – это количество вируса т.е доза в еденице обьема вируссодержащего материала. 3 метода титрования: 1 метод: титрование вируса по инфнкционному действию вируса со статестическим оцениваемым эффектом. По методике рида и менчу или по керберу. Титр выражается в 50% дозах. Это ЭД50. Для этого метода титрования можно испльзовать любую биологическую модель но эта модель должна быть чувствительна к титруемому вирусу(клеточные культ; эмбрионы; лаб животные). По инфекционному действию зараженных биологических моделей делят на по следующим признакам: по клинически призн; по патоморфологическим изменен; по гибели модели; по накоплению гемагглютинина. От дозы вируса зависят результаты работы. Установлено что доза вируса вызывающая 50 проц инфекционный эффект наименее подвержена колебаниям и является наиболее определяемой из всех возможных доз. Титр выражается в эффективных 50 проц дозах. Это ЭД 50. В зависимости от испльзуемой биологической модели и от полученного эффекта 50 проц доза может выражаться в следующих еденицах: ЛД 50 – это 50 проц летальная доза получаемая на лаб жив по летальному эффекту. ИД 50 – это 50 проц инфекционная доза определяемая на лаб жив по клиническим признакам или по патоморфологическим изменениям. ЭЛД 50 – это 50 проц эмбриональная летальная доза определяемая на куриных эмбрионах по лет исходу. ЭИД 50 – это 50 проц эмбриональная инфекционная доза определяемая на куриных эмбрионах по патоморфологическим измен и по накоплению гемагглютинина. ЦПД 50 – это 50 проц цитопатогенная доза определяемая на клеточных культурах по цпд. Если в зараженных системах мы не наблюдаем 50 проц эффекта те ИД 50 то титр расчтываем по риду и менчу: lg ЛД 50 = lg ВКД – (% лет ВКД – 50 %) / (% лет ВКД - % лет НКД) ВСЕ ЭТО УМНОЖЕННОЕ НА lg кратности разведения. 2 метод : по инфекционному действию вируса с оценкой еденичного эффекта. При методе бляшкообразования в клеточной культуре – еденичный эффект. Выражается в оспо образующих еденицах или в бляшко образ ед БОЕ. Готовят 10 кратное разведение вируса; подбирают чувствит биологическую модель; в каждом разведении вируса заражают не менее 4 эмбрионов. Титр вычесляют по формуле Т=а деленная на V*n. а- среднее количество оспин или бляшек. V – это оббьем вурусодерж материала=0.2. n- это степень разведения вируса. 3 мотод: по гемаглютинирующему действию вируса в ГАЕН. Ставят РГА.
38.Принципы лабораторной диагностики вирусных инфекций.
Лабораторные исследования играют важную роль в установлении диагноза инфекционных болезней, назначении этиотропной терапии, проведении контроля за эффективностью лечения. Процесс специфической лабораторной диагностики основан на выявлении возбудителя и ответной реакции организма человека в ходе инфекционного процесса. Он состоит из трех этапов: сбора материала, транспортировки его (шпора№39), и его исследования в лаборатории: 1)Вирусологический метод включает два основных этапа: выделение вирусов и их идентификацию. Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных. Наличие вируса в зараженных культурах определяют по развитию специфической дегенерации клеток, т.е. цитопатогенному действию, обнаружению внутриклеточных включений, а также на основе выявления специфического антигена методом иммунофлюоресценции, положительных реакций гемадсорбции и гемагглютинации. Вирусы идентифицируют с помощью иммунологических методов: реакции торможения гемагглютинации, связывания комплемента, нейтрализации, преципитации в геле, иммунофлюоресценции. 2)Серологические реакции; 3)Иммунологический метод (биопробы); 4)ИФА и ПЦР. После получения результатов обследования и с учетом эпизоотологических и клинических данных устанавливают заключительный диагноз.
39.Взятие, подготовка и пересылка пат. Материала для вирусолог. Исследования.
Взятие, транспортировка и исследование пат. материала регламентируется ветеринарным законодательством. При взятии учитывают тропизм вируса – предпочтительная локализация вируса при данной болезни, и патогенез. Время от взятия пат. материала до конца его исследования – 2-4 часа. Если времени нужно больше – консервировать(хим.методы – 50% р-р глицерина, физ. – замораживание), но не для люминисц. микроскопии. Транспортировка в спец. контейнерах с сопроводит. документом и нарочным. Подготовка заключается в извлечении из клеток вируса. Жидк. материал – фильтрация и центрифугирование. Для очищения от бактерий – бактериальн. фильтры и антибиотики (500-2000 ЕД на 1 мл), от грибов – фунгициды(25 ЕД на 1 мл), держат 30-40 мин, делают посевы на питат. среды (аэробы –МПА, МПБ, МПЖ, анаэробы –Китта-Тароцци, грибы –Чапека, Сабуро). Плотный пат.материал: 1) берут пат.материала 1-1,5 г; 2)ножницами измельчают; 3)рстирают со стерильн. стеклом или песком в ступке; 4)10% суспензия с р-ром Хенкса; 5)2 раза замораживают и оттаивают; 6)фильтрация через марлевый фильтр; 7)центрифугирование (3000 об/мин, 15 мин); 8) надосадочная жидкость – вируссодержащий материал, его проверяют на бактерии(пит. среды), добавляют антибиотики и фунгициды.
40.Микроскопический метод исследования в вирусологии.
1.Световая микроскопия: 1)для обнаружения вируса оспы(метод серебрения по Морозову); 2)Для обнаружения телец-включений (это скопление вирионов или из частей или продуктов реакции клетки на вирус; они м.б. внутриядерые и цитоплазматические); 3)обнаружение ЦПД вируса(округление, фрагментация, гибель); 4) обнаружение симпластов; 5)работа с К/К; 6) оценка серолог. реакций(ИФА, РГАд, РТГАд). 2.Люминисцентная микроскопия:суть – при облучении УФ-лучами атомы возбуждаются, потом переходят в начальное состояние с выделением энергии в виде светового излучения, интенсивность его оценивают в крестах(изумруд.-зел. = ++++; зел. = +++; зел.-желт. = ++; желт. = +; нет свечения = –).Перед облучением препарат красят флюорохромами(ФИТЦ, акредин оранжевый, желтый, родамин).Это протое флюорохромирование. Сложное – МФА.Суть МФА – специфич. взаимодействие антитела с меченой флюорохромами сывороткой(конъюгатом). 3.Электронная микроскопия: 1)обнаружение любого вируса; 2)исследование его размеров, формы, структуры, типа симметрии, репродукции; 3)исследование взаимодействия вируса с клеткой.
У нас есть собственная национальная специализированная коллекция бактерий и вирусов. Ученые десятилетиями кропотливо собирали образцы со всего мира. Ради чего?
Проходя мимо государственного учреждения “Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии” Министерства здравоохранения, расположенного на минской улице Филимонова, многие даже не подозревают, что веселенькой сине-голубой окраски корпус на самом деле является практически неприступной крепостью. Именно здесь хранится национальная коллекция вирусов и бактерий, множество из которых могут с легкостью убить человека и вызвать эпидемию мирового масштаба.
Я у входа в здание. На меня в упор смотрят фасадные видеокамеры. Руки в карманы, вразвалочку прохожу по вестибюлю, гадая, так ли строго охраняются страшные экспонаты коллекции. Разумеется, проводить диверсию я не намерен, но любопытно.
Чтобы попасть на территорию Коллекции, нужно открыть дверь с помощью электронной карты. И зайти получится лишь в небольшой тамбур. Дверь с тревожной надписью “Опасная зона” и говорящим ядовито-желтым значком биологической угрозы - следующий уровень защиты.
Далее по широкому коридору - комната наблюдения. Здесь постоянно дежурит персонал. На монитор выведены картинки с внутренних камер. Сколько их? Десять? Двадцать? Во-первых, эта мера позволит выявить непрошеного гостя, если такой и появится в стенах здания. Хотя такое полностью исключено.
Во-вторых, поможет максимально быстро отреагировать, если сотруднику в одном из лабораторных помещений понадобится помощь.
Через толстое двухслойное стекло заглядываю в очередное помещение. Мощнейшие микроскопы с выводом картинки на мониторы компьютеров. Ряды пробирок и колб, биксы с инструментами. Дверь цельнометаллическая. Не взломаешь, не пробьешь. А вот на электронную карточку Ларисы Михайловны преграда отзывается тихим щелчком. Провожатая поясняет, что она - одна из очень немногих, кому разрешен доступ во все помещения центра. Большинство же сотрудников имеют доступы лишь в ограниченное их количество.
Работа с инфекционным материалом - опасными вирусами и бактериями - проводится в лабораторных помещениях так называемой заразной зоны, которая отделена от “чистой зоны” санпропускником. Через окно в коридоре заглядываю в ядро центра, где между лаборантом и вирусом происходит контакт.
Впрочем, таких знакомых по фильмам-катастрофам силуэтов в скафандрах я не замечаю. Люди одеты в рабочие халаты, в обычных медицинских перчатках и легких респираторах. От страшной смерти их отделяет стекло и металл боксов. Именно там, в этих коробах, через толстые встроенные перчатки и манипуляторы ставят эксперименты над опасными вирусами.
До сих пор никаких происшествий не случалось. Однако исключать вероятность ни в коем случае нельзя. Поэтому каждый сотрудник проходит специальную подготовку по соблюдению правил работы с инфекционным материалом и аттестацию для получения допуска к работе, который утверждает директор центра. Среди вопросов тестирования есть и такой: “Как следует поступать в случае если в помещении разбился флакон с вирусом?” Единственный правильный ответ: “Этого не может быть”.
Я недоумеваю. Воспитанный, по большому счету, на голливудских фильмах про всяческие зомби-апокалипсисы и глобальные эпидемии, я четко знаю: все беды мирового масштаба начинаются с того, что нерадивый лаборант спотыкается и роняет хрупкий сосуд с содержимым. Обязательно на металлическую поверхность или аккурат на уголок стола. Звонкое “бзынь”, легкое облачко тумана, брызги жидкости, камера крупным планом показывает решетку вентиляции. Сирены, мигающий свет, крики о помощи... Все в таком духе.
В реальности в нашей стране никто не работает с вирусами первой и второй группы патогенности (самые агрессивные из четырех существующих) так, чтобы была возможность что-то разбить или сломать.
Как емкость с плененным вирусом доставляется в центр? Лариса Рустамова демонстрирует небольшой металлический контейнер. Открывает плотно пригнанную крышку. Внутри - емкости с хладагентом, между которыми зажат пластиковый футляр. И только в нем - жестко зафиксированный флакон. Прямо как в сказке: в зайце - утка, в утке - яйцо, в яйце - игла, а на конце ее - смерть... Правда, в моем случае вся эта “капуста” содержит пустую пробирку. А вот “одежки” со смертоносной начинкой “снимаются” лишь в боксах, перед защитными системами которых пасует даже самая злобная и всепроникающая хворь.
Во всех внутренних помещениях, за герметичными дверями, поддерживается особый режим вентиляции, в боксах - отрицательное давление. Предположим самый плохой вариант: флакон со страшным содержимым в защитной линии разбит вдребезги. В этом случае воздух, попутно прихватив вирус, со свистом потянется в вентиляционные каналы. А там - сложная система фильтров тонкой очистки, которые улавливают частицы вируса.
Разумеется, вентиляция выйти из строя не может?
На случай отключения электроэнергии даже в масштабах города у нас предусмотрен автономный электрогенератор, который подключается автоматически.
В наше время происходит всеобщая глобализация. Границы между странами стираются, туристы колесят по всему миру, привозя с собой самые разные заболевания. Именно по этой причине в морозильных камерах центра наравне с вирусами и бактериями, выделенными на территории страны (гриппом, клещевым энцефалитом, гепатитом) хранятся и особо опасные возбудители геморрагических лихорадок. Есть Эбола, вызывающая в 90 процентах случаев летальный исход пораженного, и не менее коварный вирус Ласса - возбудитель тяжелейшей геморрагической лихорадки. В коллекции также вирус Марбург, впервые выделенный в Германии и в свое время унесший жизни большого количества людей. О вирусе Зика сегодня знают все. Ученые центра его пленили и стали изучать еще во времена СССР.
Никто не может гарантировать, что в один прекрасный момент чума, оспа, когда-то погубившие миллионы людей, а нынче исчезнувшие, не появятся вновь. Именно по этой причине в центре эпидемиологии и микробиологии ученые хранят даже “списанные” самой природой вирусы и бактерии.
Кратко о моральном аспекте. За несколько дней до моего прихода в лабораториях центра как раз закончили исследования с опасными вирусами на лабораторных животных. Подопытными традиционно стали мыши, морские свинки.
Как вы можете спокойно смотреть в глаза зверушкам, львиную долю которых сознательно обрекаете на смерть? - провоцирую собеседницу.
Разумеется, искренне жаль, что приходится проводить такие эксперименты. Но, извините, речь идет о здоровье человека, о существовании нации в целом. Представьте, вы видите перед собой заболевшего ребенка, которому не можете помочь лишь потому, что в свое время задались вопросом: “А как бы мне побольше мышей сохранить?”. Приоритеты нужно расставлять правильно.
